发布时间 : 星期六 文章PCR扩增原理和操作步骤更新完毕开始阅读0489232ff6ec4afe04a1b0717fd5360cba1a8de0
作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/,l，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度(浓度差以10倍为一个梯度)。在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
2+5(Mg浓度
2+Mg对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为
2+2+200,mol/l时，Mg浓度为1.5,2.0mmol/l为宜。Mg浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚合酶
2+2+均有相应的缓冲液，而Mg也已添加，如果特殊实验应采用无Mg的缓冲液，，在PCR反应体系
2+中添加一定量的Mg。 三、PCR反应特点 PCR反应具有以下特点: 1(强特异性
PCR反应的特异性决定因素为:(1)引物与模板DNA特异性的结合;(2)碱基配对原则;
)Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;(4)靶基因的特异性与保守性。 (3 其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩
增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
2(高灵敏度
-12PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10g)量级的起始待测模板扩增到-6微克(,g = 10g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
3(快速简便
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性,退火,延伸反应，反应一般在2,4小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪(荧光时时定量PCR仪)则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。
4(低纯度模板
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
第二节 PCR扩增反应的实施 一、PCR反应的条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 1(温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90,95?变性，再迅速冷却至40,60?，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70,75?，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100,300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、
退火与延伸温度可合二为一，一般采用94?变性，65?左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
(1)变性温度与时间:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93?,94? lmin足以使模板DNA变性，若低于93?则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
(2)退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40?,60?，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55?为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值(解链温度)=4(G+C)，2(A+T) 复性温度=Tm值-(5,10?)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30,60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
(3)延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性:70,80?，150核苷酸/S/酶分子;70?，60核苷酸/S/酶分子;55?，24核苷酸/S/酶分子;高于90?时，DNA合成几乎不能进行。
(4)PCR反应的延伸温度一般选择在70,75?之间，常用温度为72?，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3,4kb的靶序列需
3,4min;扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
2(循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在30,40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
二、PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
1(凝胶电泳分析:PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
(1)琼脂糖凝胶电泳:通常应用1,2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳:6,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
2(酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
3(分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
4(Southern印迹杂交:在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。