发布时间 : 星期一 文章病毒包装相关知识汇总更新完毕开始阅读0b4ba8b8541810a6f524ccbff121dd36a32dc4c9
一个成功的诱导表达系统，需要达到以下效果：
a、对于诱导激活系统来说，需要在未激活前保持很低的表达水平，而激活后，能迅速地高水平并且稳定表达。
b、对于诱导关闭系统来说，需要在关闭前可以维持正常的表达水平，而添加诱导关闭物后，能迅速彻底地关闭基因的表达。
而影响诱导表达系统构建成功的因素主要有以下几点：
a、诱导表达载体自身调控元件：包括启动子的强弱、启动子对诱导物的响应效果、载体启动子外其它调控元件对插入片段表达的影响。解决方案包括使用组合诱导物以达到更佳效果，改造其它调控元件以减少泄露表达。
b、稳定整合位点：由于构建诱导表达系统必须在稳定细胞株中实现，所以，稳定整合位点附近的转录活性对诱导表达系统影响很大。转录活性过低，导致诱导激活效果不佳，转录活性过高，导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。因此需要构建多株稳定细胞株，并进行比较，挑取诱导前后均符合预期的一株进行实验。
3)稳定整合后拷贝数：拷贝数过高也会导致诱导激活前表达水平过高或者诱导关闭后仍然有残留表达。所以建议使用逆转录(包括慢病毒)载体获得单拷贝细胞稳定株。 7、如何使用病毒液去感染靶细胞？
不同的重组病毒载体，不同的细胞，以及动物体内组织细胞侵染，其具体的操作步骤都有所不同。所以建议研究人员依据具体的实验选择不同的操作步骤。 8、病毒可以高效感染任何靶细胞吗？
理论上，现有的病毒载体可以在任何条件下高效感染任何靶细胞。其依据是，病毒载体高效感染细胞主要受三个参数影响：
细胞特性：分裂和非分裂细胞、体内所处环境是否存在血脑屏障等阻碍。现有的病毒载体，综合起来，既可以侵染分裂细胞，也可以侵染非分裂细胞，而且还可以突破血脑屏障高效侵染脑神经细胞。
细胞种类：不同组织细胞。虽然不同载体对不同组织细胞的侵染有倾向性，但通过改造病毒载体决定病毒表面糖蛋白的序列，即使针对同一类病毒，也可以获得最高达数百种不同侵染特性的载体系列，从而可以满足不同细胞类型的侵染需求。
病毒载体的滴度。 除不同类病毒其滴度会不同外，病毒载体的滴度还受包装片段的特性影响，包括插入片段的毒性和大小。外源片段的毒性可以通过使用诱导调控系统或者改造病毒包装细胞系来减轻毒性影响，而插入片段的大小的影响可以通过选择对外源片段具不同容纳能力的病毒载体来避免。
金开瑞拥有庞大的病毒载体库，可以最广程度地覆盖各种组织细胞，同时可以覆盖不同特性的细胞，还拥有各种诱导表达系统和经过改造的病毒包装细胞系可以包装具有细胞毒性的外源插入片段。
9、如何才能用重组病毒载体在细胞上做出满意的结果？
病毒载体在细胞试验中要想取得满意的结果，主要在以下几个方面：
①病毒载体在不同的细胞由于细胞表面受体的差异而不同转导效率不同，尽量选择转导效率高的细胞，可用参考文献报道和转导报告基因进行筛选。
②良好的细胞状态。
③最好在细胞状态最佳时感染病毒。特别是不要在消化细胞后不久就感染，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏，应该培养过夜后再感染病毒，效果较好。
④适当的转导MOI（病毒基因组数/细胞的比），一般可用105上下做倍比稀释。 ⑤适当的转导体积，如24孔板可用200ul，6孔板0.5ml。
⑥转导时间为1-2h，每25分钟晃动培养板混匀一次。（转导时，最好换用无血清培养基，因为血清对病毒的感染有些许不利影响）
⑦可加合适辅助药物刺激，增强表达。
⑧适当表达检测时间，如是分泌蛋白可每24h连续取培养上清检测。通常蛋白表达量在几百纳克至几微克/ml水平。
10、如何才能用病毒载体在动物体内做出满意的结果？
病毒载体在动物试验中要想取得满意的结果，主要注意以下几个方面：
①选择适当的血清型：例如不同的AAV血清型在动物体内同一组织有不同的转导效率，如AAV1在肌肉组织中、AAV5在肺组织中有很高的转导效率。
②选择适当的靶器官：同一血清型AAV在不同的组织具有不同的转导效率，尽量选择转导效率高的靶器官。
③转导途径：尽量选择局部直接多点注射靶器官。
④转导病毒量：根据经验，所加病毒量太多表达量反而会降低。
⑤检测时间：根据经验不同基因的表达高峰时间是不同的，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上的时间。 11、用于体内试验的重组病毒，是否要求纯化？
是的，病毒纯化很有必要。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的病毒外壳和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主强烈的免疫反应。另外，纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。 12、病毒可以浓缩或稀释吗？方法如何？
可以浓缩：对于一般实验室用户，可以采用高速离心办法浓缩。目前市面上的病毒浓缩纯化办法很多，有不少商业化产品。不同的病毒纯化办法不同。腺病毒载体可以用300K以下的浓缩离心管（PALL 公司产品）进行浓缩。一般来说浓缩后的滴度以不超过3×1012v.p/ml为宜，过浓可能导致病毒聚集而产生沉淀。
可以稀释：在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如PBS、生理盐水等。稀释后的样品尽量一次用完。 13、病毒一定要浓缩么？
病毒一般可以收两次，可以在 48 h 和 72 h 各收一次。如果你不想麻烦浓缩病毒的话，也可以不浓缩，直接将收集的病毒上清作为要感染的细胞的培养基，但是可能效果会不太好。并且一般收病毒时，培养基的营养已经损耗了很多，那样直接培养感染细胞会损害细胞，所以建议还是进行浓缩后再感染。
14、VP，PFU，IFU 的区别？哪一个能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？
VP：病毒颗粒（viral particle），是“活”（有感染性）和“死”（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。在体内实验中，它代表了进入肌体可能引起宿主针对腺病毒的免疫反应的腺病毒颗粒总量。测定方法是OD260法，只有经过纯化的腺病毒才能通过此方法测定VP/ml值。
PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的“活”的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。测定方法是将腺病毒样品经过一系列梯度稀释后，感染293细胞并培养，通过计算细胞病变空斑数得到腺病毒样品中PFU/ml值。
IU：感染单位（infectious unit），和PFU一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是TCID50法。
VP/PFU或VP/IU的值是判断腺病毒纯品中活病毒所占比例的重要依据。如果该病毒产品要用于人体实验，按中国生物制品质量要求，该比值应该在33以下。用于普通实验研究，该比值要求可以适当放宽。 15、感染细胞最佳MOI的测定？
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞，比如HeLa、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。
16、重组病毒产品如何运输和保存？
病毒产品一般采取干冰运输。
避免重组病毒反复冻融，请酌情分装后于-80℃保存，建议不要在-20℃下长期保存。在我们提供的保存液中，病毒产品-80℃保存期为半年。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。病毒产品解冻后最好保持在冰浴中，并尽快使用。如果解冻后的病毒一时用不完，滴度足够高时，4℃可保存1~2周。但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。 17、所提供这些病毒产品的安全性如何？
使用病毒载体的危险性主要有以下几个考虑因素： a、是否能重组产生致病性病毒； b、是否具备复制能力；
c、是否能整合，并导致癌基因激活或者抑癌基因失活； d、免疫原性。
金开瑞所使用的病毒载体，全部经过改造，去除了致病性元件和复制功能区，因此重组产生功能性病毒的概率极低。一部分病毒(腺病毒和腺相关病毒载体)，其整合几率低，因此安全性高。同时，针对部分具备整合能力的病毒载体(慢病毒载体)，还去除了其3’LTR内的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。因此，这些病毒载体用于体外和动物实验，对使用者而言都具有极高的安全性。有的病毒载体，比如腺相关病毒载体，即使用于人体，也被认为是安全性非常高的一类基因治疗载体。尽管如此，我们建议，使用病毒载体进行细胞
或动物实验时，需要遵循标准废弃病毒载体操作流程。 18、如何保证病毒包装实验室安全？
病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！
所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行病毒安全培训或提示。
——关于慢病毒
1、慢病毒载体的特点及应用范围？
慢病毒载体是有包膜的RNA病毒，可以感染分裂和非分裂细胞（而逆转录病毒只能感染有丝分裂活性的细胞），在感染宿主细胞后不能自我复制。以水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）包膜G蛋白VSV-G替换野生型包膜蛋白，使重组慢病毒感染范围覆盖了各种传代和原代的肿瘤细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞，以及干细胞、T细胞等。
2、金开瑞生物的重组慢病毒使用何种系统？
金开瑞生物使用第三代慢病毒包装系统，包括3个辅助质粒、1个用于插入目的基因的转移质粒，三个毒粒组装必须的基因（Pol，Gag，Rev）被分开装载于不同的质粒上，包装过程中必须4质粒共转才能成功出毒，最大限度降低了重组概率。同时三代转移质粒的5’和3’ LTR都删除缺失了野生型的U3，成为不能自我复制的自灭活（SIN）载体。 3、慢病毒载体生物安全性如何？
重组慢病毒载体已经删除了所有野生型毒性基因，感染细胞后只表达装载的目的基因，不表达任何野生型病毒的基因，自灭活序列修饰使其不能复制，包膜糖蛋白做了pseudotyped替换为VSV-G。因此三代包装系统的改造保证了慢病毒载体的生物安全性，目前未有致瘤报道。
4、影响慢病毒产量的因素有哪些？
包装过程中，慢病毒的产量随着插入片段的增大而呈指数下降，一般当目的基因＞2k时即会可见显著的出毒效率降低，当接近4k时，其出毒量会低至可以使用的下限、或几乎不出毒。
插入序列的GC含量＞70%时，产量会受到影响。一些对包装细胞有毒性的基因，也会导致难以产毒。
5.、慢病毒载体可以容纳多大的插入基因？
整个慢病毒基因组在5’和3’ LTR之间的最大容纳能力约9k，由于转移载体中各种表