发布时间 : 星期日 文章蛋白质糖基化修饰研究进展更新完毕开始阅读0d36b8b5f46527d3250ce09e
通过β- 消除米氏加成反应在修饰位点处连上相应的强反应活性基团，从而可以特异性地富集目的蛋白或多肽。Wells 等借鉴磷酸化研究方法利用 β-消除后 DTT或生物素戊胺米氏加成的方法使原 O- 糖基化位点被标记，标记后的多肽可以通过亲合的方法富集，而且通过采用同位素标记的试剂有望实现定量和比较分析。 3.2 糖蛋白鉴定 / 糖基化位点的确定方法 3.2.1PNGase F酶法
这是目前糖蛋白组学研究中应用最为广泛的一种N-糖蛋白鉴定方法。肽:N-糖苷酶F(peptide: N-gly-cosi-dase F,PNGase F)几乎可以作用于所有的N-糖链,同时使天冬酰胺转变为天冬氨酸,造成相对分子质量增加0. 98,从而起到质量标记N-糖基化位点的作用。这种方法应用十分方便,但是不能区分自发脱氨基和酶促去糖基化,使得测定会有一定误差。另外0. 98的质量差异对某些质谱仪来说尚难以区分。 3.3.2 Endo H酶法
与PNGase F不同,内切-β- N-乙酰葡糖胺酶H(endo-β-N-acetylglucosa minidase H, Endo H)在去糖基化时会将N-糖链五糖核心中与天冬酰胺相连的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)以外的部分切除,而在糖基化位点处留下GlcNAc,从而起到标记糖基化位点的作用。糖基化位点处的GlcNAc使得该处天冬酰胺残基的相对理化质量增加203,这对于质谱的准确度要求不高。
3.2.3三氟甲基磺酸(trifluoromethananesulphonic acid,TFMS)法
该法可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基,留下的糖基则起到标记糖基化位点的作用。此方法反应温和,速度较快且可以作用于所有类型的糖链。作为一种广谱、高效温和的方法,TFMS法用于糖蛋白组学的前景还是很诱人的。只是该法在操作时要保持严格的无水条件,且糖链末端唾液酸的存在会影响反应效率。
4糖蛋白糖链结构分析
蛋白质的糖基化分析除了包括确定糖基化位点在那个氨基酸残基以外,对于糖链结构的分析同样非常重要。目前分析糖链结构的方法如下: 4. 1 质谱法
经典质谱分析技术通常采用酶法或者化学的方法把糖链与肽链分开,再分别在氨基酸序列水平或者糖链水平进行进一步的分析。有研究采用膜上样品直接质谱分析技术,这种技术需要的样品量极小,因此1个2-D胶上的蛋白质点可以被分为若干份进行处理,一部分用蛋白酶进行酶解,用于蛋白质的鉴定,另一部分用糖苷酶进行酶解,用于寡糖链结构的研究,再将这两部分结合起来,就可以得到糖肽的信息。 4. 2 核磁共振法(NMR)
目前,NMR技术已成为糖链立体化学结构分析最重要的方法之一,可确定糖链的构型、连接位置、分支和微观多样性。Kogelberg等从人乳中分离出一种未果糖型和3种不同果糖型的寡糖。通过ES-MS和NMR的结合使用确定其结构特点,通过ES-MS/MS分析阐明其分支类型、 血型相关刘易斯决定簇、部分序列和寡糖链连接情况,最后通过甲基化分析和1H-NMR确定其全序列。最终鉴定出三种新的糖链结构:未果糖结构,单果糖结构和三果糖结构。但NMR测定糖的讯号峰重叠严重,解析较难,灵敏度不高,而且多维NMR需要毫克级样品,这对多数糖复合物中的微量糖链是很难达到的。 4. 3 芯片技术
以糖芯片和凝集素芯片为代表的亲合芯片技术可利用糖链与凝集素之间的特异识别和结合能力间接给出糖链的相关结构信息,是目前高通量快速分析蛋白质糖基化类型的良好工具。Zheng等将由不同凝集素构建的凝集素芯片放入六孔板中,观察了所培养细胞表面上糖
链的表达情况。该法简单易行,通过显微镜就可获得结果。 4. 4 糖结构分析软件
糖蛋白质量数的分散及糖本身的性质决定了质谱分析的灵敏度较低,经过糖蛋白/糖肽的纯化或糖链的衍生化,如经典的甲基化或乙酰化等,可以一定程度上提高质谱检测的灵敏度,但后续的糖蛋白结构分析仍然有很多困难,由于糖链的微观不均一性,一个糖基化位点上的糖链类型就可能多达几十种,虽然高分辨的质谱可以成功的检测到这些不同的糖
(glycoform),但质谱图相对也很复杂,这些质谱图能否有效的处理及分析直接决定了糖结构分析成功与否。在研究者们的努力下,近几年也有了比较好的进展,已经出现了相对成熟的软件,如StrOligoAlgorithm算法,可以分3步自动处理糖肽的串联质谱图。
5 展望
蛋白质糖基化是沟通蛋白质和糖这二大类生物大分子的桥梁。在蛋白质组学水平进行蛋白质糖基化研究有助于全面深刻地认识蛋白质糖基化发生、发展的规律及其在整个生命过程中的生物学意义,有助于从基因组-蛋白组-糖组这样一个宏观的综合的层面上观察分析生命现象,达到对生命现象更本质的认识,进而有助于发病机制的阐明,为疾病的早期诊断、治疗等提供更科学的指导。另一方面,当前的蛋白质组学研究热潮也为糖生物学研究的发展提供了千载难逢的机会。作为一类重要的信息中介分子,糖只有与其他诸如蛋白质、脂类的糖基化等放在一起研究才更接近其本质含义。相信随着蛋白质糖基化分析技术的不断发展与完善,作为蛋白质修饰谱研究重要组成部分的蛋白质糖基化研究必将在加深对蛋白质生物功能多样性认识的同时,极大地拓展对于糖类的生物学功能的认识。
参考文献
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The Research Progress in Protein Glycosylation
Abstract:Giycosylation is one of the most common, important, andcomplicated post-translational modifications of proteins. The oligosaccharide chains of glycoproteins have vital roles in protein conformation, activity, and localization, as well as participate in many biological processes, such as molecular and cellular recognition, signaling, and communication.This article reviewed the types of glycosylation、its function 、 glycosylated sites analysis and oligosac-charide analysis.
Keywords: Protein Glycosylation;research method