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7、层析技术（chromatography）在酶分离纯化中的应用 什么是层析技术：
一、色谱分离法：最早用于工业生产，分离色素。
二、几种层析分离方法（原理，为什么可以/要选择某一方法（纯化方法根据蛋白质性质选择））
（一）吸附层析（adsorption chromatography）（最主要的一种）
1、原理：利用物理吸附剂对不同物质吸附能力的不同而使混合液中各组分分离的方法。 2、吸附：见书 3、吸附剂：
4、固体物质之所以具有吸附作用，见书
内部、表面作用力不同，向内一面作用力大，向外一面作用力小
5、吸附的三个基本环节：加样、吸附、洗涤和洗脱（解吸、吸附、再解吸、再吸附不断重复）
吸附力、解吸力不同
吸附力小解吸力大移动距离较大，吸附力大解吸力小移动距离较小。 经过适当时间后形成各自区带，若无色，则用显色剂 6、特点：
①来源丰富、价廉、可再生、吸附设备简单。
②有些吸附剂使用前要预处理，以除去杂质，提高吸附力，增强分离效果。 ③上样时低pH值和低离子强度，半小时后提高pH值和离子强度洗脱。 （二）离子交换层析（ion exchange chromatography）
1、原理：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种分离方法。
2、根据活性基团性质不同可分为：
阳离子交换剂：能吸附带“+”的离子或酶 -CM-（羧甲基）、-PO32-（磷酸基）、-SO3-（磺酸基） 阴离子交换剂：能吸附带“-”的离子或酶 -DEAE（二乙基氨基乙基）、-TEAE（三乙基氨基乙基）
3、为什么可以通过离子交换的方式来纯化酶和蛋白：利用蛋白所带电荷性质不同。 蛋白质/酶在不同的pH条件下，将发生不同的离解作用，而带不同的电荷，选择相应的离子交换剂，同时要考虑被分离酶的稳定性。
4、如何改变一个蛋白质的电荷性质：改变缓冲液的pH值，根据蛋白质等电点进行调节 pH大于等电点，酶分子带负电荷，用阴离子交换剂 pH小于等电点，酶分子带正电荷，用阳离子交换剂
5、如何使蛋白质适用该方法：先知道其等电点、调节pH试出其所带正负电荷、选择交换剂。
6、操作要点
（1）离子交换剂的预处理：浸泡吸胀， 再用HCl或 NaOH交换处理，离子交换树脂和凝胶用2~3倍于树脂体积的2mol/L，离子交换纤维素用0.5mol/L酸、碱处理。 （2）装柱：湿法装柱，离子交换剂上样前抽气泡。 （3）平衡、加样：1%~5%上样量。 （4）洗脱、收集：
梯级洗脱（分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度） 梯度洗脱（连续改变pH或盐离子强度）
（5）再生：离子交换剂要再生，和预处理程序相同。 （三) 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）
1、原理：利用各组分分子量大小不同，从而在凝胶网孔中流速不同达到分离的目的。 2、作用：分离纯化
鉴定你要纯化的分子天然状态下以几聚体形式存在（单聚体/二聚体等） 3、常用的凝胶种类（适用范围见书）
（1）葡聚糖凝胶 Sephadex G-X
（2）琼脂糖糖凝 Sepharose 2B、4B、6B （3）聚丙烯酰胺糖凝胶（PAG）
Bio-Gel P-2、4、6、??.、200、300，共10种型号。 4、操作要点
（1）装柱：装柱前要吸胀和抽气。常温吸胀需较长时间，可加热溶胀。 （2）上样：加样量不超过3%。
（3）洗脱：洗脱液应与平衡时的溶液一致。 （4）再生：无须经过再生处理。
（5）长期不用时，可加0.02%的NaN3保存。 5、为什么加样量不超过3%？
（四) 亲和层析（affinity chromatography）
1、原理：利用生物分子与配基之间所具有的可逆亲和力，使生物分子分离纯化的层析技术。
生物分子对间的专一而又可逆的结合力，称为亲和力，利用这种亲和专一性的特点，而制备专门的亲和吸附剂，用其进行蛋白质等生物分子的层析纯化，就是亲和层析，效率特别高。
2、操作要点：
(1)要先洗涤后洗脱,用含有与亲和吸附剂相同的高浓度配基或另一种配基洗脱。 （2）柱床要再生
第五章 酶的分子修饰 1、什么是酶分子修饰？
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 2、酶分子修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 肽链有限水解修饰 侧链基团修饰 氨基酸置换修饰
酶分子的物理修饰 3、酶分子修饰的意义
提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性 4、酶分子修饰的基本要求和条件 从两方面考虑 （1）酶的稳定性
热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 （2）酶活性中心的状况
活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。
（1）pH与离子强度
pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也
不同。
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例 5、 酶修饰后的性质变化
热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。
抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。
半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。
最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。
Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。 6、酶的金属离子置换修饰 1、把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分。
若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。
2、金属离子置换修饰的过程（怎样做）
a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 7、酶的大分子修饰
1、大分子修饰(共价)的过程 修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。
分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
2、为什么用PEG修饰
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫