发布时间 : 星期日 文章无内毒素质粒小量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书更新完毕开始阅读104062e59f3143323968011ca300a6c30c22f114
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EndoFree Plasmid Mini Kit 无内毒素质粒小量快速提取试剂盒
目录号：PL04 ?
试剂盒组成、储存、稳定性：
保存
室温
试剂盒组成
平衡液
20次（PL0401）
5ml 150μl 15 ml 15 ml 8ml 5ml 15 ml
50次（PL0402）
5ml 150μl 15 ml 15 ml 15 ml 5ml
RNaseA（10mg/ml） -20℃ 溶液P1 溶液P2 溶液N3 内毒素清除剂 漂洗液WB 洗脱缓冲液EB 吸附柱AC 收集管（2ml）
4℃ 室温 室温 -20℃ 室温 室温 室温 室温
第一次使用前按说明加指定量乙醇 10ml 20个 20个
15ml 50个 50个
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。 储存事项: 1.
第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.
环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 ?
产品介绍：
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本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 ? 1.
产品特点：
离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.
独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。 ?
注意事项
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，
如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议
接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、N3的用量，其它步骤相同。
3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260
值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4. 质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知
道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5.
洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM
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EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。 ? 1.
关于平衡液的使用
介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。 2.
使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
? 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示：
? 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
? 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。
1. 取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液，12,000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌
体。
收集超过1.5 ml菌液， 可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
2. 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3. 加250μl的溶液P2，温和地上下翻转6 -8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。
4. 加250μl溶液N3，立即温和地上下翻转6 -8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。
13,000rpm离心10分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。 加入溶液N3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
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5. 加入0.1体积(上清的体积的10%，约80μl)的内毒素清除剂到上一步所得上清，
颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间偶尔混匀几次。
内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。 6. 常温放置3-5分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。
如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。 7. 室温14,000 x g离心10 分钟分相 。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素
和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。 平衡液预处理吸附柱：
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用” 8. 向上层水相中加入0.5体积异丙醇（约370μl）后充分颠倒混匀后分两次（每次不
超过700μl）转入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
9. 加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，
弃掉废液。再加入600μl漂洗液WB，重复漂洗一次。
10. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免
漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗
脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。