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实验十四 植物原生质体分离及融合
一、实验目的：
学习植物原生质体的分离及融合的原理，掌握其操作方法。
二、实验原理：
植物原生质体是具有质膜，但去掉了细胞壁的植物细胞，分离的原生质体在培养条件下具有再生新壁，进行连续的细胞分裂．并分化成完整植株的能力，即具有细胞全能性。细胞壁的主要成份是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶，果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁。由于质膜完全暴露，原生质体具有摄取大分子(如核酸)，细胞器(如核、叶绿体)和细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料。而原生质体融合是实现上述目的的一个极为重要的手段。同种或异种原生质体可在聚乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生物类型。
三、实验用品：
(一)材料：植物叶片(菠菜叶片)
(二)用具：倒置显微镜，离心机。过滤筛(100目)，漏斗，烧杯，吸管，长注射
针，注射器(5—10m1)等；
(三)试剂：
1、纤维素酶2％，果胶酶l％。 在0．65M甘露醇，0．05MCaCl2·2H20和0．1％MES中，PH调至5．6—6．0。 2、0．16M CaCl2·2H20溶液(内含0．1％MES)PH5．6。 3、22％蔗糖溶液。
4、30％聚乙二醇(PEG)溶液 5、高PH高钙洗脱液(PH=9) 0．1M CaCl2·2H20 0．1M梨酶醇
0．5ml／100mI 1M Tris 6、0．24M CaCl2·2H20
四、实验方法:
(一)原生质体的分离收集：
1、取菠菜叶片撕去下表皮，每小组称0．2g．切成小块放到10ml酶液中，在26℃
下酶解4—5小时，或酶含量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2、用100目的过滤筛过滤。
3、用与滤液等体积的0．16M CaCl2·2H20溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4、滤液用离心机100—300rpm，离心5分钟弃上清。
5、沉淀中加入0．16M CaCl2·2H20溶液1—2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针
头的注射器自离心管底部轻轻地加入6—8ml22％蔗糖溶液，使之形成界面。 6、静置待原生持体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管吸取收集原生质体。 7、用0.24M CaCl2·2H20溶液洗涤一次，离心吸去上清液。
8、沉淀中加入l-2ml O．16M CaCl2·2H20溶液悬浮沉淀，用血球计数板计数，使
原生质体密度为2×105个／ml。
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9、取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也可用荧光显微镜
检查。
(二)原生质体融合操作
1、取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置l0分钟，使原生质体
沉淀在载玻片上。
2、在两滴悬液之间加1滴30％PEG液，使3滴淀液相连，室温下(15℃一20℃)
作用5一l0分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。
五、作业:
l、说明原生质体脱壁是否完全，形态是否完整。 2、绘制所观察到的原生质体，粘连或融合情况。
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实验十五 植物原生质体的培养
一、 实验目的：
掌握植物原生质体的培养技术，观察原生质体再生壁和细胞分裂过程。
二、 实验原理：
植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞，原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶、下胚轴等）获得。但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致。而从单细胞和愈伤组织分离到的原生质体，由于受培养条件和继代培养的影响，易使细胞间发生遗传和生理差异。所以，从培养的单细胞和愈伤组织中获得的原生质体不是十分理想的材料。原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后分离得到。在适宜的培养条件下，分离的原生质体又可重新合成新的细胞壁，经过细胞分裂并再生成完整植株。原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞培养相似。但原生质体由于是除去细胞壁，所以培养基中有一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。培养基中添加的生长素、细胞分裂素也是必需的。
高等植物原生质体除了用于细胞融合的研究以外，还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起，已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。
三、 实验用品：
（1） 仪器：超静工作台、低速离心机、倒置显微镜、高压灭菌锅、白细胞计数板、
带盖离心管、细菌过滤器、300目镍丝网、解剖刀、镊子、注射器（2ml、5ml）、刻度吸管、培养皿、烧杯等。
（2） 材料：烟草叶片。 （3） 试剂：
1） 洗涤液：甘露醇0.6mol/L CaCl2·2H2O2 3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mol/L(PH5.6),
高压灭菌。
2） 混合酶液：2%纤维素酶、1%果胶酶溶于洗涤液中（PH5.6）,需过虑除菌。 3） DPD培养基（表8--2）。
表8—2 DPD培养基配方
成分 NH4NO3 KNO3 MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O KH2PO4 FeSO4·7H2O Na-EDTA MnSO4·H2O Na2MoO4·2H2O
含量（mh/L） 270 1480 340 570 0 27.8 37.3 5 0.1 31
成分 KI 烟酸 盐酸吡哆素 盐酸硫胺素 肌醇 叶酸 甘氨酸 生物素 蔗糖 含量（mh/L） 0.25 4 0.7 4 100 0.4 1.4 0.04 2000 H3BO3 ZnSO4·7H2O CuSO4·7H2O CoCl2·6H2O 注：培养基需过滤除菌。
2 2 0.015 0.01 甘露醇 2-4D 激动素 PH 0.3mol/L 1 0.5 5.8 四、 实验方法：
取60~100d苗龄的烟草叶片，用自来水冲洗。
70%乙醇浸30s。
0.3%次氯酸钠灭菌15min，无菌水洗5次。
无菌叶片用消毒镊子小心撕去下表皮，叶片剪成1cm2。
置混合酶液中，25℃酶解3—4h。然后在无菌下，吸一滴酶液于载玻片上，在显微镜下检查原生质体分离情况。
（6） 将酶解后的原生质体悬液，用300目镍丝网过滤到小烧杯中，以除去未酶
液完全的组织。
（7） 将滤液分装在刻度离心管中(离心管需带盖)，用600r/min的速度离心5min，
使完整的原生质体沉淀。
（8） 用吸管除去上层酶液，加入洗涤液，小心将原生质体悬浮起来，待悬液充
分混匀后，再一次离心。这样反复操作洗涤2--3次，洗净酶液与残余的细胞碎片。
（9） 加入适量（如4ml）的原生质体培养基，小心将原生质体悬浮起来，取少
量用血球计数板计数，计算血球计数板上四角的四大格内的细胞总数，按下列公式即可算出每毫升悬浮液中的细胞数。
细胞数/ml=四大格的细胞总数/4?10000?稀释倍数
离心去掉上述加入的培养基，再按计数结果加入相应量的培养基，使培养
基中悬浮原生质体的浓度为105/ml。
（10） 用吸管将原生质体悬液转入灭过菌的培养皿内，控制液体的厚度在1ml左
右，并用封口膜封住培养皿，置26℃恒温培养。
（11） 培养10d左右，在倒置显微镜下统计原生质体再生分裂的频率。
（12） 当大部分原生质体再生了细胞壁并有部分发育成愈伤组织（约两周左右）
时，添加含0.2mol/L甘露醇的新鲜培养基。
（13） 培养一个月左右，出现瘤状愈伤组织时，将其转入MS培养基附加
NAA0.2mg/L,6-BA 3mg/L的固体培养基上，诱导芽的分化。
注意事项：
所分离到的原生质体是否健康和具有活力，是以后培养成功的关键因素之一。下面两种方法可以用于测定原生质体的活力。
方法一：染色法。可用荧光素双醋酸盐（fluorescein diacetate, FDA）、酚藏花红伊文思蓝等染料对原生质体染色后，显微镜检查原生质体7的活力。FDA染色后，在荧光显微镜下检查，活的原生质体发出黄绿色的荧光。0.01%酚藏花红染色后，光学显微镜检查，活的原生质体染成红色。用0.25%伊文思蓝染色，染成蓝色的原生质体为无活性。
方法二：胞质环流法。在显微镜下观察，凡是有胞质环流者，为代谢旺盛的原生质体。原生质体的产量和活力与所用酶的质量和处理有关，每克材料搭约加10ml酶液。原生质体培养基的密度是影响培养成功与否的重要因素，起始密度一般为
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