发布时间 : 星期二 文章靶向MRP1基因pRNAT-H1.1以及shuttle-RFP重组质粒表达载体构建 - 毕业设计论文-精品 - 图文更新完毕开始阅读21f0635a89eb172dec63b77d
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双蒸H2O，溶解后用5MNaOH调PH值至7.0，定容至200ml，共配置5份，121℃湿热灭菌30min。
4、固体选择培养基（Ampr）：每100ml LB液体培养基中加1.5g琼脂粉，121℃湿热灭菌20min，待温度降至60℃加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，混匀后倒平板，4℃保存备用。
2.1.4.2 大提质粒溶液配置
(1)溶液I：50mmol/L C6H12O6，25mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 (2)溶液II：0.2mol/L NaOH，1% SDS。
(3)溶液III：5mol/L KAc600mL， 冰乙酸115mL，H2O 285mL。
(4)溶菌酶（现用现配）：取0.1g溶菌酶溶于10mL 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）。 (5) PEG8000缓冲液：取6.5g PEG8000溶于50mL 1.6mol/L NaCl.。 (6) 70%乙醇：取300mL无水乙醇溶于700mL水中。
(7) TE（pH8.0）缓冲液：1mol/L Tris-HCl（pH8.0）500μL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100μL，加水至50mL。
2.1.5 主要仪器
微量振荡器（MM-2型） 微量振荡器（MM-2型） 恒温空气摇床 电子天平
紫外分析仪（ZF型） 低温离心机（SK18） 低温离心机（SK18） PCR仪（9600型） 恒温磁力搅拌器（2003-16） 恒温水浴锅 自动双重纯水仪
上海像华化工有限公司 上海像华化工有限公司
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2.2 实验方法
2.2.1 shRNA的设计与退火
根据siRNA设计原则[34]，根据MRP1靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔9nt茎环序列(TTCAAGAGA)，5′端带有BamHⅠ酶切位点，3′端带有HindⅢ酶切位点，用BLAST进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。shRNA的DNA模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。 干涉靶点在mrp1基因mRNA全序列中的位置如下(粗体代表靶序列)：
1 ccaggcggcg ttgcggcccc ggccccggct ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc 61 gccgccgccg ccgccgccag cgctagcgcc agcagccggg cccgatcacc cgccgcccgg 121 tgcccgccgc cgcccgcgcc agcaaccggg cccgatcacc cgccgcccgg tgcccgccgc 181 cgcccgcgcc accggcatgg cgctccgggg cttctgcagc gccgatggct ccgacccgct 241 ctgggactgg aatgtcacgt ggaataccag caaccccgac ttcaccaagt gctttcagaa 301 cacggtcctc gtgtgggtgc cttgttttta cctctgggcc tgtttcccct tctacttcct 361 ctatctctcc cgacatgacc gaggctacat tcagatgaca cctctcaaca aaaccaaaac 421 tgccttggga tttttgctgt ggatcgtctg ctgggcagac ctcttctact ctttctggga 481 aagaagtcgg ggcatattcc tggccccagt gtttctggtc agcccaactc tcttgggcat 541 caccacgctg cttgctacct ttttaattca gctggagagg aggaagggag ttcagtcttc 601 agggatcatg ctcactttct ggctggtagc cctagtgtgt gccctagcca tcctgagatc 661 caaaattatg acagccttaa aagaggatgc ccaggtggac ctgtttcgtg acatcacttt 721 ctacgtctac ttttccctct tactcattca gctcgtcttg tcctgtttct cagatcgctc
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3181 gctcagcctc tggactgatg accccatcgt caacgggact caggagcaca cgaaatagtccg 3241 gctgagcgtc tatggagccc tgggcatttc acaagggatc gccgtgtttg gctactcc 3301 ggccgtgtcc atcgggggga tcttggcttc ccgctgtctg cacgtggacc tgctgcacag 3361 catcctgcgg tcacccatga gcttctttga gcggaccccc agtgggaacc tggtgaaccg 3421 cttctccaag gagctggaca cagtggactc catgatcccg gaggtcatca agatgttcat 3481 gggctccctg ttcaacgtca ttggtgcctg catcgttatc ctgctggcca cgcccatcgc 3541 cgccatcatc atcccgcccc ttggcctcat ctacttcttc gtccagaggt tctacgtggc 3601 ttcctcccgg cagctgaagc gcctcgagtc ggtcagccgc tccccggtct attcccattt 3661 caacgagacc ttgctggggg tcagcgtcat tcgagccttc gaggagcagg agcgcttcat 3721 ccaccagagt gacctgaagg tggacgagaa ccagaaggcc tattacccca gcatcgtggc 3781 caacaggtgg ctggccgtgc ggctggagtg tgtgggcaac tgcatcgttc tgtttgctgc 3841 cctgtttgcg gtgatctcca ggcacagcct cagtgctggc ttggtgggcc tctcagtgtc 3901 ttactcattg caggtcacca cgtacttgaa ctggctggtt cggatgtcat ctgaaatgga 3961 aaccaacatc gtggccgtgg agaggctcaa ggagtattca gagactgaga aggaggcgcc 4021 ctggcaaatc caggagacag ctccgcccag cagctggccc caggtgggcc gagtggaatt 4081 ccggaactac tgcctgcgct accgagagga cctggacttc gttctcaggc acatcaatgt 4141 cacgatcaat gggggagaaa aggtcggcat cgtggggcgg acgggagctg ggaagtcgtc 4201 cctgaccctg ggcttatttc ggatcaacga gtctgccgaa ggagagatca tcatcgatgg
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根据2个靶序列设计的2对DNA干涉片段mrp1-1，mrp1-2序列见表2.1；2.2：
表2.1 根据靶位点合成的干涉片段1（mrp1-1）序列 Table 2.1 siRNA sequence synthesized according to target 1point 1
Mrp1 靶序列1 正义链（2-sense）
aattctcaatgggatcaaagt
5′-GATCCaattctcaatgggatcaaagtTTCAAGAGAactttgatcccattgagaattTTTTTTGGAAA-3′
反义链（2-antisense） 5′-AGCTTTTCCAAAAAAaattctcaatgggatcaaagtTCTCTTGAAactttgat
cccattgagaattG-3′
表2.2 根据靶位点合成的干涉片段2（mrp1-2）序列 Table 2.2 siRNA sequence synthesized according to target 1point 2
Mrp1 靶序列2 正义链（3-sense）
ggatcaagaccgctgtcat
5′-GATCCggatcaagaccgctgtcatTTCAAGAGAatgacagcggtcttgatccTTTTTTGGAAA-3′
反义链（3-antisense） 5′-AGCTTTTCCAAAAAAggatcaagaccgctgtcatTCTCTTGAAatgacagc
ggtcttgatccG-3′
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