发布时间 : 星期日 文章靶向MRP1基因pRNAT-H1.1以及shuttle-RFP重组质粒表达载体构建 - 毕业设计论文-精品 - 图文更新完毕开始阅读21f0635a89eb172dec63b77d
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（2）取两支感受态细胞悬液，各加入5μL上述连接产物，轻轻摇匀，同时设立转化阳性对照组（加1μL pUC19质粒）和阴性对照组（不加质粒）。 转化体系如下：
名称 实验组1 实验组2 空白对照 阳性对照 阴性对照 自连对照
（3） 各组放置冰上30分钟， 42℃水浴中热击90s，迅速置于冰上冷却2min。 （4）向各管中加入1mL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1h，保证恢复细菌正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp）。
（5）将上述菌液4000r/min离心，弃800μL上清后。混匀后取100μL 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h（培养箱中）。、
所加物质 P1.1-1 （5μL） P1.1-2 （5μL） 水（1μL） 原质粒（1μL） E.coli DH5α（1μL） 双酶切后的质粒（1μL）
标记 A B C D E F
2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子
灭菌牙签挑取LB筛选平板上圆滑单菌落，先在预先分隔并标记的另一LB平皿上划板，然后点入制备好的PCR反应混合液，开始扩增。PCR反应条件为：
模 板 10×buffer
dNTP（10mmol/L） 正向引物（载体通用引物） 反向引物（载体通用引物） Taq酶（2U/μL） ddH2O
单菌落 2.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.5 μL 17.7 μL
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模 板
10×buffer without MgCl2 MgCl2 （25 mmol/L） dNTP （2.5mmol/L） 正向引物（载体通用引物） 反向引物（载体通用引物） Taq酶（2U/μL） ddH2O
单菌落 2.5 μL 1.8 μL 0.5 μL 1μL 1μL 0.5 μL 17.7 μL
94℃预变性2分钟；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环；72℃ 延伸1分钟，4℃保存，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。划板的平皿于37℃培养12-16h。
2.2.5 测序鉴定重组载体
将小提鉴定结果正确的质粒送交上海生工生物工程技术服务有限司，以载体反向引物为测序引物。将经鉴定后未发生突变的H1.1-1、H1.1-2靶向MRP1基因siRNA重组质粒的宿主菌摇瓶扩大培养后，进行质粒大量提取,方法如2.1.2.3.1所述。
2.2.6 重组质粒大提的OD值检测
按照优化的碱裂解法大提质粒，稀释50倍后利用Genespec进行OD值检测。
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第3章 结果与分析
3.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果
3.1.1 质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒经HindⅢ和BamHI双酶切结果见图3-3，结果显示单酶切产物大小约为6200bp，双酶切产物略小于单酶切产物，与预期结果相符。
6000bp
1.1 kb marker ； 2. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒； 3.HindIII和BamHI双酶切；4. HindIII单酶切
图3-3双酶切pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒
1.1kb DNA ladder ;2. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒3. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP cutted by HindⅢand
BamHI 4. pRNAT-H1.1/shuttle-RFP cutted by BamHI Fig.3-3 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP digested by enzyme
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3.1.2 目的片段的回收
目的片段回收结果见图3-4 ,结果显示回收产物大小约为6Kb，与预期结果相符。
1 2 3
6000bp
图3-4胶回收质粒片段
1、 1kb marker 2、质粒经Hind Ⅲ单酶切产物3、回收的双切产物
Fig.3-4 Recovery products of linear plasmid
1、1kb marker 2、pRNAT-H1.1/shuttle-RFP digested by HindⅢ 3、Recovery products of p1.1 plasmid digested by double enzymes
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