发布时间 : 星期三 文章挥发性脂肪酸VFA测定步骤与方法更新完毕开始阅读23f4b98227fff705cc1755270722192e44365878
挥发性脂肪酸的测定
一、GC（Gas chromatograph）工作条件
仪器： GC-14B型气相色谱仪（日本岛津公司）
毛细柱：NUKOLTM Capillary Column ( Supelco )；Column
No.34292-07B
30m×0.32mm×0.25μm film thickness
气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130℃，汽化温度180℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为氮气，压力为60 KPa，氢气压力为50 KPa，氧气压力50 KPa，灵敏度（档）为101，衰减3.0 二、样品制备 1．试剂制备
（1）配制25%w/v 的偏磷酸溶液，将25g偏磷酸溶在100mL双蒸水中
（2）巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆酸，定容到100mL。 （可先用80 ml双蒸水，加热溶解偏磷酸，然后定容至100 ml）
（3）标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100 g、丙酸0.3700 g、丁酸0.1765 g、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自定容至100 mL。 2．样品制备
(1) 发酵液取（或过滤瘤胃液）VFA测定 1ml样品到离心管中，再加入0.2 ml的偏磷酸巴豆酸混合溶液，－20℃冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心5min，取上清液保存，测定前再12000rpm离心5min(或少许通过0.22μm针式滤器，滤液直接进样用1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2－1.0μL。
(2) 食糜及粪样VFA测定 取1g置于离心管中，加入5－10倍的双蒸水，混合均匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其它步骤同上。 3．保留时间的确定
与样品处理相同，在1 ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴豆酸的混合样，上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。 4．有机酸浓度的计算
通过标准样品和内标巴豆酸各自的（或浓度）和峰面积可以计算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量（或浓度）与其峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。
（样品某酸峰面积值×巴豆酸标样峰面积×某酸标样浓度） 某酸浓度(mM)＝
（样品中巴豆酸面积值×标样某酸峰面积）
挥发酸标样的质量和换算的浓度 标样浓度 质量/g/100mL 分子量 浓度/mM 巴豆酸 0.6464 86.09 75.08421 乙酸 0.9246 60.05 153.9717 丙酸 0.3713 74.08 50.12149 丁酸 0.1787 88.11 20.28147 异丁酸 0.174 88.11 19.74804 戊酸 0.1904 102.14 18.64108 异戊酸 0.205 102.14 20.07049
5．有机酸重现率
将某有机酸（如乙酸）连续上样几次，测定其峰面积值，利用某酸峰面积值和内标峰面积值计算其重现率。 乙酸重现率变异系数： 1.2872±0.06404 丙酸重现率变异系数： 0.5104±0.01961 丁酸重现率变异系数： 0.3422 ±0.01037 异丁酸重现率变异系数： 0.4668±0.01447 戊酸重现率变异系数： 0.1431±0.01754 异戊酸重现率变异系数： 0.1671±0.03496
6. 不同标样有机酸的GC峰形
乙酸 巴豆丙酸 酸 异丁酸 丁酸
异戊酸
戊酸 乙酸 丙酸 异丁酸
丁酸 混合标样 样品
异戊 酸
戊酸 巴豆酸 标样的分子量和出峰时间
巴豆酸 乙酸 丙酸 丁酸 异丁酸 戊酸 异戊酸
气相色谱的气体工作条件（VFA测定）
沸点 118℃ 141℃ 163.5℃ 154.5℃ 分子量 86.09 60.05 74.08 88.11 88.11 102.14 102.14 出峰时间 1.95min 0.87min 1.0min 1.2min 1.06min 1.68min 1.38min