发布时间 : 星期日 文章制备丁二酸相关方法更新完毕开始阅读268e19a5e209581b6bd97f19227916888586b948
niger SL-09培养液，60℃保温10 min后，降温到37 ℃，接入A. succinogenes SF-9进行同步糖化发酵，发酵72 h。产丁二酸59 g/L，在此基础上采用补料发酵，发酵过程总投入约菊芋粉192 g/L（总计还原糖134 g/L），发酵96 h，丁二酸浓度98 g/L，表明同步糖化发酵菊芋原料生产丁二酸有较好的应用价值。 木质纤维素原料生产丁二酸
木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，用于工业发酵原料的木质纤维素主要有农业废弃物如秸秆、木材和木质生物质等。木质纤维主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素是由b-1，4-糖苷键连接而成的多糖，半纤维素是由带支链的多聚糖（主要是已聚糖和戊聚糖）组成的杂多糖，而木质素是一种酚醛聚合物。三者组成的木质纤维素具有很强的抗水解和酶解特性，因此木质纤维素作为发酵原料必须经过预处理才能使用。
美国芝加哥大学的Donnelly2004年申请了 基因工程菌（ptsG、pflB、ldhA突变株AFP184，AFP400，AFP404）发酵工业级水解液（Arkenol′s hydrolysate，玉米水解糖浆和纤维素水解糖浆）生产丁二酸的专利。采用两段式发酵，前期耗氧（6h），后期流加含有木糖的工业级水解糖浆并通CO2厌氧发酵，192 h积累丁二酸63 g/L，丁二酸对底物的产率在:1~:1。有报道该技术已于2002年在Applied CarboChemials Inc.（ACC）公司进行了中试规模试验。
韩国 Lee PC等报道了木材水解液发酵产丁二酸。采用2mm×4 mm大小的橡木块，于215 ℃汽爆预处理，再用纤维素酶，按每克底物20IU的用量，在50 ℃下水解3d，得到含葡萄糖和木糖分别为20 g/L和7 g/L的木材水解液。在木材水解液发酵培养基中（含还原糖糖27 g/L，玉米浆10 g/L）分批发酵，积累丁二酸 g/L，对糖产率和生产强度分别为88%和 g/(L· h)。Kim DY等研究了 MBEL55E发酵木材水解液生产丁二酸，在橡木材水解液发酵培养基灭菌前，用NaOH预处理以减少灭菌过程所产生的抑制物质，NaOH处理后的木材水解液含葡萄糖16 g/L，木糖7 g/L， MBEL55E发酵12 h，积累丁二酸 g/L，丁二酸产率56%，生产强度从未预处理时的 g/(L·h)提高到 g/(L·h)，在稀释速率 h的条件下连续发酵，丁二酸的产率55%，生产强度提高到 g/(L·h)。瑞典Hodge等研究了软木材稀酸水解液脱毒及脱毒水解液用于基因工程菌E. coli AFP184生产丁二酸的发酵。稀酸水解木质纤维素的过程中，会产生对微生物生长与发酵有害的酚醛类等物质。采用云杉木碎片，先在PH值2、170 ℃的条件下稀硫酸水解7 min，以水解其中的半纤维素，余下固体部分再在pH值2、200 ℃的条件下稀硫酸水解10 min，合并两步酸水解液，浓缩后用5%活性炭吸附脱毒。E. coli AFP184在脱毒水解液发酵培养基中，菌体生长与产酸加快；而在未经脱毒处理的水解液发酵培养基中，菌体不能生长与产酸。将脱毒处理的水解液用于E. coli 的丁二酸发酵，先好氧培养11 h，再厌氧发酵
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42 h，可积累丁二酸 g/L，丁二酸产率72%。
国内姜岷等报道了用玉米皮水解液为原料发酵产丁二酸。粒径为20~40目的玉米皮在料液比18%，l10 ℃，l%硫酸条件下水解90 min，总糖浓度达85 g/L，总糖收率90%。酸水解液用活性炭脱色，脱色率达92%，脱色的总糖损失率低于5%，糠醛含量仅为 g/L。脱色后的糖液用于A. succinogenes NJ113发酵产丁二酸，初始糖浓度为50 g/L时，丁二酸浓度达 g/L，丁二酸产率为%，验证了玉米皮水解液可替代葡萄糖作为丁二酸发酵的碳源。陈可泉等用酸水解玉米纤维，采用CaCO3中和与活性炭脱色处理酸水解液，有效去除了水解液中抑制发酵的物质，得到的水解糖液用于A. succinogenes NJ113发酵产丁二酸，在发酵罐上，产丁二酸浓度达 g/L，丁二酸产率%。
李兴江等报道了水解玉米秸秆发酵生产丁二酸。采用碱解和酶解法处理，40目的玉米秸秆按1:5的比例在PH值12的碱性水溶液中，95 ℃搅拌60 min，然后用50 Hz超声处理30 min，硫酸中和PH值至中性，分离硫酸钙沉淀。清液中加入纤维素酶和半纤维素酶，60 ℃搅拌酶解180 min。200 g秸秆粉水解得到52 g葡萄糖和24 g木糖。通过优化培养基中镁、锰、亚铁、锌离子和维生素的含量以及CO2与H2的比例、氟乙酸的浓度，A. succinogenes FH-7发酵产丁二酸浓度达到73 g/L。采用酸解和酶解法，玉米秸秆先经180 ℃汽爆10 min，再用%硫酸高压水解，水解后固体部分用纤维素酶和半纤维素酶在50 ℃下酶解72 h，合并两部分水解液，2000 g干秸秆共得到154 g木糖和293 g葡萄糖。用A. succinogenes 的pta-adh突变株，在10 L发酵罐中发酵，总糖浓度为64 g/L，发酵液积累丁二酸56 g/L。
此外，有报道日本地球环境产业技术研究机构成功地使用转基因棒状杆菌，从废纸中制取出琥珀酸，最终可从每升培养液中提取约30 g的琥珀酸，认为可将琥珀酸制造成本降低90%。目前发酵生产的丁二酸的价格在~美元/kg。基于这一生产成本，上述的丁二酸衍生物比目前石化原料生产的有竞争力或接近有竞争力。发酵法生产的丁二酸通过多年的实验，以及不同国家公司中试的实践，在技术、环保、安全、经济等指标的考核均已经成为一个共识，这个工艺线路有潜力成为大量生产化学制品，也可作为大部分重要的中间产物和专业化学制品得基础。上述文献报道的研究结果反映了利用这些廉价的原料生产丁二酸，具有良好的可行性和应用前景。
（4） 发酵法生产丁二酸的提取研究进展
与石化法工生产丁二酸相比，采用生物发酵法可降低一些生产成本，其中分离提取技术大约占总生产成本的50%。廉价生物质如木质纤维素的应用虽能降低发酵成本，但也向发酵液中引入更多的外来成分，包括蛋白质、木质素、果胶以及纤维素等，并且目标产物的浓度
通常比单糖发酵偏低，另外除了目标产物，发酵液中本身还存在一些其他的化合物，如代谢副产物、细胞和残留的原料等，最终导致其下游分离过程比单糖发酵或化学合成更难规模生产。目前微生物发酵生产丁二酸的分离方法主要包括以下几种：沉淀法、电渗析法、溶剂萃取法以及离子交换法。 沉淀法
沉淀法主要包括钙盐法、铵盐法以及近来研究比较多的酯化法。 钙盐法
通过加入氢氧化钙或氧化钙生成沉淀，以达到从发酵液中分离的效果，是传统工业上分离羧酸的常用方法。钙盐法的具体步骤如下：先加入氧氧化钙或氧化钙，将得到的丁二酸钙盐从发酵液中过滤分离出来，用浓硫酸处理，得到副产物硫酸钙，游离的酸通过一些方法（如：活性碳、离子交换等）进行纯化，最后蒸馏得到丁二酸晶体（图）。钙盐法因为工艺成熟、设备简单、原材料易得和产品质量稳定等特点而在国内外被广泛使用。但经过这么多年的应用，其缺陷日益显露：一是得到的提取液中丁二酸质量分数较低，增大了后续浓缩段的负荷；二是单元操作损失多，总收率低；三是在提取过程中丁二酸经历了多次相变，消耗化工原料多，固液分离量大，能耗高；四是环境污染严重，产生大量的固体废弃物CaSO4，每生产出l mol的丁二酸产品，就产生出等摩尔的石膏副产物。因此，钙盐法提取有待于进一步的提高。
图 钙盐法提取流程简图
铵盐法
Berglund和Dunuwilal在美国专利中，提出一种即不消耗大量试剂，也不产生大量副产物的生产和纯化丁二酸的工艺，在生产过程中硫酸铵副产物可实现循环利用。生产及纯化的
第一步是种子接种到发酵罐中，用NaOH调节发酵液的以上，在PH为的时候最佳。第二步是通过过滤器，将不溶的蛋白质和杂质除去。得到的丁二酸钠质量分数为10％左右，通过多效蒸发器浓缩至50%，在结晶器中，通入CO2及氨气，将丁二酸钠盐转化为丁二酸铵盐，然后在丁二酸结晶器中，加入NH4HSO4将PH调为~，进行结晶。在这个PH下，丁二酸的溶解度最小，而且丁二酸铵与硫酸氢铵反应生成硫酸铵和丁二酸，所以丁二酸能析出来。通过过滤器，洗涤，再通过甲醇纯化器，将丁二酸从相对不溶的硫酸盐中分离出来，最后蒸发，可以得到纯的丁二酸。甲醇蒸发，被回收到甲醇贮罐中。从结晶器出来的NaHCO3可以被用来调节发酵罐的PH。从过滤器出来的滤液含有(NH4)2SO4、残留的丁二酸、NH4HSO4及硫酸，与甲醇纯化器中出来的硫酸盐一起进入热分解器中。这个过程是为了将残留的丁二酸从硫酸盐中分离出来，以减少送入热分解器中的硫酸盐混入有机物，在分解过程中造成焦化。硫酸盐大部分为硫酸铵，部分为残留的硫酸氢铵和硫酸，将其置于热分解器中，温度维持在300℃左右。在这个温度范围内，硫酸铵裂解成为氨和硫酸氢铵，也可能形成硫酸。硫酸氢铵、残留的硫酸和残留的未分解的(NH4)2SO4可循环到丁二酸结晶罐，氨可加到结晶罐中将钠盐转化成铵盐。
结晶器中出来的滤液包含甲醇和残留的丁二酸，在甲醇分离器中蒸馏后，残留的丁二酸和一些硫酸盐水溶液与发酵罐出来的稀丁二酸二铵溶液混合一起进入多效蒸发器浓缩。这样就完成了一个闭合的清洁生产流程，整个工艺流程中，结晶的丁二酸是唯一的产物（图）。
目前铵盐法提取工艺流程只是实验阶段，是利用模拟体系的丁二酸通过铵盐法提取收率达到%，硫酸的回收率为％，甲醇的回收率为％。铵盐法路线长，结晶过程条件比较苛刻，还需要高温裂解硫酸盐，步骤繁琐，难度大，操作费用高，增加了运行成本，不利于发酵制备丁二酸的规模化生产。