发布时间 : 星期一 文章各种微生物生化试验方法原理更新完毕开始阅读29758b1859eef8c75fbfb31e
(3)将接种后的试管置35℃中,培养24～48h。
(4)观察培养基颜色变化.石蕊在酸性条件下为粉红色,碱性条件下为紫色,而被还原时为白色。 5.尿素试验
(1)取两支尿素培养基斜面试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。 (2)分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 (3)将接种后的试管置35℃中,培养24~48h。
(4)观察培养基颜色变化.尿素酶存在时为红色,无尿素酶时应为黄色。 (五)实验报告 1.结果
将结果填入下表,\表示阳性,\表示阴性
菌名 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 淀粉水解试 验 脂肪水解试 验 明胶液化试 验 石蕊牛奶试 验 尿素试验 2.思考题
(1)你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ (2)不利用碘液,你怎样证明淀粉水解的存在？
(3)接种后的明胶试管可以在35℃培养,在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？ (4)解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？ (5)为什么尿素试验可用于鉴定Proteus细菌？
二、糖发酵试验
(一)目的要求
1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用 2.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法 (二)基本原理
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖.发酵培养基含有蛋白胨,指示剂(溴甲酚紫),倒置的德汉氏小管和不同的糖类.当发酵产酸时,溴甲酚紫指示剂可由紫色(pH6.8)变为黄色(pH5.2).气体的产生可由倒置的德汉氏试管中有无气泡来证明..
图.糖发酵试验
A. 培养前的情况;B. 培养后产酸不产气; C. 培养后产酸产气 (三)器材
1.菌种 大肠杆菌,普通变形杆菌斜面各一支。
2.培养基 葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支(内装有倒置的德汉氏小试管)。
3.仪器或其他用具 试管架,接种环等。 (四)操作步骤
1.用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。
2.取葡萄糖发酵培养基试管3支,分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为照.另取乳糖发酵培养基试管3支,同样分别接入大肠杆菌,普通变形杆菌,第三支不接种,作为对照。在接种后,轻缓摇动试管,使其均匀,防止倒置的小管进入气泡。 3.将接种过和作为对照的6支试管均置37℃培养24~48h。 4.观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 （五）实验报告 1.结果
将结果填入下表.\表示产酸或产气,\表示不产酸或不产气
糖类发酵 大肠杆菌 普通变形杆菌 对照 葡萄糖发 酵 乳糖发酵 2.思考题
假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖,发酵试验应该出现什么结果？
三、IMViC与硫化氢试验 (一)目的要求
了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法 (二)基本原理
IMViC是吲哚(indol test),甲基红(methy1 red test),伏一普(Voges-Prokauer test)和柠檬酸盐(citrate test)四个试验的缩写,I是在英文中为了发音方便而加上的.这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),多用于水的细菌学检查.大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中若超过一定数量,则表示受粪便污染.产气肠杆菌也广泛存在于自然界中,因此检查水时要将两者分开， 硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验
吲哚试验是用来检测吲哚的产生.有些细菌能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸.吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚.但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力,因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 大肠杆菌吲哚反应阳性,产气肠杆菌为阴性。
甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸,乙酸,乳酸等.当细菌代谢糖产生酸时,培养基就会变酸,使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色(pH6.3)变为红色(pH4.2),即甲基红反应.尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸,但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的.这两个细菌在培养的早期均产生有机酸,但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4,而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物,如乙醇,丙酮酸等,使pH升至大约6.因此大肠杆菌为阳性反应,产气肠杆菌为阴性反应。
伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力,如丙酮酸.丙酮酸进行缩合,脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰.二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物,即伏-普反应阳性;不产生红色化合物者为阴性反应.有时为了使反应更为明显,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。 柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用.有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源,如产气肠杆菌;而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐,如大肠杆菌.细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后,产生碱性化合物,使培养基的pH升高,当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时,培养基就会由绿色变为深蓝色.溴麝香草酚蓝的指示范围为:pH小于6.0时呈黄色,pH在6.0~7.0时为绿色,pH大于7.6时呈蓝色.
硫化氢试验是检测硫化氢的产生,也是用于肠道细菌检查的常用生化试验.有些细菌能分解含硫的有机物,如胱氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等,就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。
以半胱氨酸为例,其化学反应过程如下:
CH2SHCHNH2COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑ H2S+Pb(CH3COO)2→PbS↓+2CH3COOH (黑色)
大肠杆菌为阴性,产气肠杆菌为阳性。 (三)器材
l.菌种 大肠杆菌,产气肠杆菌。
2.培养基 蛋白胨水培养基,葡萄糖蛋白胨水培养基,柠檬酸盐斜面培养基,醋酸铅培养基。 在配制柠檬酸盐斜面培养基时,其pH不要偏高,以浅绿色为宜,吲哚试验中用的蛋白胨水培养基中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨,如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨较好。 3.溶液或试剂 甲基红指示剂,40%KOH,5%α-萘酚,乙醚,吲哚试剂等。 (四)操作步骤 l.接种与培养
(1)用接种针将大肠杆菌,产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中(硫化氢试验),置37℃培养48h。
(2)将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基(吲哚试验),2支葡萄糖蛋白胨水培养基(甲基红试验和伏-普试验),2支柠檬酸盐斜面培养基和2支醋酸铅培养基中,置37℃培养2d。 2.结果观察
(1)硫化氢试验 培养48h后观察黑色硫化铅的产生。 (2)吲哚试验
于培养2d后的蛋白陈水培养基内加3~4滴乙醚,摇动数次,静置1~3min,待乙醚上升后,沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂,在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。 配制蛋白胨水培养基,所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的,如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。 (3)甲基红试验
培养2d后,将l支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴,培养基变为红色者为阳性,变黄色者为阴性。
注意甲基红试剂不要加得太多,以免出现假阳性反应。 (4)伏-普试验
培养2d后,将另1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入5~10滴40%KOH,然后加入等量的5%α-萘酚溶液,用力振荡,再放入37℃温箱中保温15~30min,以加快反应速度.若培养物呈红色者,为伏-普反应阳性。 (5)柠檬酸盐试验
培养48h后观察柠檬酸盐叙面培养基上有无细菌生长和是否变色，蓝色为阳性,绿色为阴性。 （五）实验报告 1.结果
将实验结果填入下表.\表示阳性反应,\表示阴性反应.
菌名 大肠杆菌 产气肠杆菌 对 照 硫化氢试验 吲哚试验 甲基红试验 柠檬酸盐试 验 2、思考题
(1)讨论IMViC试验在医学检验上的意义.
(2)解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理,为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸活性的指示剂,而不用丙酮酸？
(3)为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性,而产气肠杆菌为阴性？ 这个试验与伏一普试验最初底物与最终产物有何异同处？ 为什么会出现不同？
(4)说明在硫化氢试验中,醋酸铅的作用,可以用哪种化合物代替醋酸铅？