发布时间 : 星期一 文章有机化学实验讲义(1) - 图文更新完毕开始阅读2d0a36740912a216147929bd
丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 水 乙酸
增 加
影响柱色谱分离的因素包括：①吸附剂；②溶剂的极性；③相对于需待分离的物料量的柱子尺寸（长度和直径）；④洗脱的速率。借助于仔细选择各种条件，几乎任何混合物均可被分离，甚至可以用光学活性的固定相来分离对映异构体。
5．柱色谱装置
色谱柱装置是一根带有下旋塞或无下旋塞的玻璃管，如图2.8. 11所示。一般来说，吸附剂的质量应是待分离物质质量的25～30倍，所用柱的高度和直径比应为8:1。表2.8.8给出了样品质量、吸附剂质量、柱高和直径之间的关系，实验者可根据实际情况参照选择。微量和半微量柱色谱装置见图2.8. 12。
2.11 柱色谱装置
表2.7 样品和吸附剂质量与色谱柱高和直径的关系
样品质量/g
0.01
吸附剂质量/g
0.3
色谱柱直径/cm
3.5
色谱柱高度/cm
30
0.10 1.00 10.00
3.0 30.0 300.0
7.5 16.0 35.0
60 130 280
6．操作方法
(l)装柱装柱是柱色谱中最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效果。装柱前应先将色谱柱洗干净，进行干燥，垂直固定在铁架上。在柱底铺一小块脱脂棉，再铺约0.5 cm厚的石英砂，然后进行装柱。装柱分为湿法装柱和干法装柱两种，下面分别加以介绍。
①湿法装柱将吸附剂（氧化铝或硅胶）用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲打边倒入柱中，同时，打开下旋塞，在色谱柱下面放一个干净并且干燥的锥形瓶，接收洗脱剂。当装入的吸附剂有一定高度时，洗脱剂下流速度变慢，待所用吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5 cm厚的石英砂。覆盖石英砂的目的是使样品均匀地流入吸附剂表面；并当加入洗脱剂时，防止吸附剂表面被破坏。在整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于吸附剂最上端，否则柱内会出现裂痕和气泡。
②干法装柱在色谱柱上端放一个干燥的漏斗，将吸附剂倒入漏斗中，使其成为细流连续不断地装入柱中，并轻轻敲打色谱柱柱身，使其填充均匀，再加入洗脱剂湿润。也可以先加入3／4的洗脱剂，然后再倒入干的吸附剂。因为硅胶和氧化铝的溶剂化作用易使柱内形成缝隙，所以这两种吸附剂不宜使用干法装柱。
装柱时表面不平整或柱子未被夹持在两个平面中完全垂直的位置，会造成谱带重叠。第二条谱带最前面的边缘在第一条谱带洗脱完毕之前就开始洗脱出来了（见图2.13）。吸附剂表面或内部不均匀，有气泡或裂缝，会使谱带前沿的一部分从谱带主体部分中向前伸出，形成沟流(见图2.14)。
图2.12 微量及半微量色谱装置 图2.13水平的和非水平的谱带前沿的对比
(2)展开及洗脱当溶剂下降到吸附剂表面时，立即开始使用色谱柱。把样品溶解在最少量体积的溶剂中，该溶剂一般是展开色谱的第一个洗脱剂。用滴管把样品溶液转移到色谱柱中，并用少量溶剂分几次洗涤柱壁上所沾试液，直至无色。注意不要让溶剂将吸附剂冲松浮起。样品加完后，打开下旋塞，使样品进入石英砂层后，再加入洗脱剂进行洗脱。样品中各组分在吸附剂上经过吸附、溶解、再吸附、再溶解……按极性大小有规律地自上而下移动而相互分离。
色谱带的展开过程也就是样品的分离过程。在此过程中应注意：
①洗脱剂应连续平稳地加入，不能中断。样品量少时，可用滴管加入。样品量大时，用滴液漏斗作储存洗脱剂的容器，控制好滴加速度，可得到更好的效果。
②在洗脱过程中，应先使用极性最小的洗脱剂淋洗，然后逐渐加大洗脱剂的极性，使洗脱剂的极性在柱中形成梯度，以形成不同的色带环。也可以分步进行淋洗，即将极性小的组分分离出来后，再改变洗脱剂的极性分出极性较大的组分。
图 2.14 表面不平整（1）或空气泡（2）造成的沟液
③在洗脱过程中，样品在柱内的下移速度不能太快，但是也不能太慢（甚至过夜），因为吸附表面活性较大，时间太长会造成某些成分被破坏，使色谱扩散，影响分离效果。通常流出速度为每分钟5～10滴，若洗脱剂下移速度太慢，可适当加压或用水泵减压。
④当色谱带出现拖尾时，可适当提高洗脱剂极性。
(3)层析柱的检测在分离有色物质时，可以直接观察到分离后的“色带”，然后用洗脱剂将分离后的“色带”依次自柱中洗脱出来，分别收集在不同容器中，或者将柱吸干，挤压出柱内固体，按“色带”分割开，再用适宜溶剂将溶质萃取出来。然而大多数有机化合物是无色的，因此最常用的方法是收集一系列固定体积的馏分，用薄层层析法进行检测，确定哪些馏分中的化合物是相同的，然后把它们合并。
另一检测方法是将无机磷光体混合于吸附剂中，经此法处理过的吸附剂填充柱在紫外光照射下会发射荧光。当有溶质存在时，荧光消失，并出现暗带，从而可观察到分离后各“色带”的位置。
在研究工作中，重力柱色谱已大量被加压柱色谱所代替。由于使用的吸附剂更细（23～24 μm，230～240目），加压柱色谱不仅省时，且更有效。从开始到完成洗脱，通常约需15 min。小直径吸附剂固定相每英寸(6.5 cm2)约需10 kg压力，为此，需要特殊的装置（图2.15），用压缩空气或氮气作为施压气体。
7．微量柱色谱
微量柱色谱(图2.16)可分离10～30 mg的样品，常用来除去产物中的杂质。微量柱色谱通常用硅胶作吸附剂（用量约3 9），用尺寸合适体积较大的滴管作色谱柱，用薄层色谱作为先导选择合适的洗脱剂。将硅胶与极性最小的洗脱剂调成糊状，用滴管转移至色谱柱中至号高度(见图2.16)。基本操作与常量色谱法相同。