发布时间 : 星期五 文章厦门大学生命科学学院-厦门大学生物医学仪器共享平台更新完毕开始阅读30481a92df80d4d8d15abe23482fb4daa58d1df8
注意事项及填写说明（送样前必读）
1. 如果阅读完以下说明仍然不知道如何准备样品，请到生命科学学院黄朝阳楼D102咨询或者打电话（谢昌传：18759271136；吴雅颖：15960262629）；三合一质谱仪Thermo Orbitrap Fusion Lumos只接受蛋白样品委托做样。
2. 主要提供以下技术服务：1. 蛋白质测序: 样品含量较高或纯度较高时，通过谱图得到肽段的序列，进而得到整个蛋白的准确序列，可用于辅助判断不稳定蛋白的氨基酸断开位置。2. 蛋白质定性分析: 用于鉴定未知蛋白或得到与已知蛋白相互作用的未知蛋白。3. 蛋白质定量分析: 采用标记定量（SILIC，iTRAQ、TMT）或非标记定量（Label free），分析某组织或细胞的蛋白表达差异。4. 蛋白质翻译后修饰位点鉴定分析，如：磷酸化、泛素化、乙酰化、N-糖基化、硫化修饰和甲基化等（如果要鉴定其它蛋白质翻译后修饰，务必先与老师联系是否能做）。5. 提供蛋白质酶解、肽段抽提及脱盐、样品上机和数据分析服务。
3. 样品准备好后，请登录生物医学仪器共享平台（http:// http://121.192.179.197/），点击“质谱-蛋白质组”，找到“Thermo Orbitrap Fusion Lumos”，点击“送样预约”，根据预约要求选择正确的“计费规则”（ 1.简单样品：只切一个条带或一个点的考染或者银染样品，样品胶体积不超
过300uL；只含单一蛋白的溶液样品；IP跑SDS-PAGE胶后，泳道分成多个组分的（胶体积小于300uL/样品）。 2.复杂样品： (1)IP后的粉末样品或者溶液样品；（2）不需要进一步分组分的组织、细胞蛋白提取样品。 3.如果需要进一步分组份的样品，要先与管理仪器的老师联系如何选择计费规则）。如果不清
楚需要选择哪一个“计费规则”，请先到D102室咨询。预约后两小时之内，把样品和填写好的“检测申请单”一起送至黄朝阳楼D102。
4. 样品不能含有SDS、TritonX-100、NP-40、PEG、Tween-20、甘油和CHAPS等去污剂（会抑制目的蛋白的信号）；只收用Tripsin酶解的样品，如需用其它蛋白酶进行酶解需先来询问是否可以使用该酶，所用的蛋白酶需要自行准备。
5. 所送样品所属的蛋白库要在uniprot.org能搜索到，或者自己提供正确格式的蛋白库文件。 6. 胶样品（SDS-PAGE）： （1） 要求
胶切成1.5 mm X 1.5 mm大小的块状，放入1.5 mL 离心管内，可以不脱色，保存在1 mL纯水中，或者用乙腈脱色液脱色后保存在乙腈脱色液中；单个样品胶体积不能超过300 ?L；
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（2） 制样注意事项
? 准备样品过程中要注意减少角蛋白污染，所用器具要求极干净。
? 样品尽可能跑在一条泳道内，如果样品体积太大无法跑在一条泳道中最好进行浓缩处理，
以提高单位体积内蛋白含量。样品跑入分离胶的长度需要根据实验目的来定，溴酚蓝最少要进分离胶1 cm。建议如非必要胶的浓度最好不要> 10%，影响酶解效率。
? 不建议银染；或银染时，敏化不加戊二醛，染色时不加甲醛，显色时才加（戊二醛会造
成蛋白交联，影响酶解）
? 考染样品控制染色时间，不宜染色太深（看得到条带即可），然后用脱色液脱色至能看清
泳道或者目的条带即可；然后，用超纯水把脱色液清洗干净，把胶置于超纯水中浸泡至胶膨胀到为染色时的大小，即可进行切胶。（染色液，脱色液需要新鲜配制，所用器皿要求极干净）
? 在通风橱切胶，切胶时请带上口罩，女生绑好头发，采用干净的手套和一次性刀片； ? 为减少样品损失，切胶时请务必去掉非目的条带部分，尽量减少样品体积，建议每管样
品胶体积小于300ul；
? 切胶时请尽量避免条带间的交叉污染；把胶切成约1.5 mm X 1.5 mm尺寸的小块放于进
口1.5 mL 离心管内（每管内胶体积≦300 uL），然后用超纯水（ddw）洗三遍以上，随后用脱色液【40% 乙腈（ACN），50 mM碳酸氢铵（ABC）in H2O】脱至无色，样品最后保存在乙腈脱色液中。
? 请务必根据marker估计每个样品的蛋白量（多少ug或ng），否则不受理该申请单（无法
进行酶解处理）；
7. IP样品：
? 样品以溶液方式送样（必须注明样品体积uL）：A.如果从细胞裂解液中IP，裂解细胞前
用PBS清洗细胞三次，以除去细胞培养液中残留的BSA， IP后beads必须用1 mL PBS洗3次以上，置于旋转混匀器上转10 min/次（去除样品中残留的SDS，TritonX-100，NP-40，Tween-20，甘油等），把beads转移到一个新的EP管中，再用PBS洗一遍，EP管底用小针扎一个洞（孔洞直径 ———————————————————————————————— 厦门大学生物医学仪器共享平台 网址：http://121.192.179.197 电邮：bio-center@xmu.edu.cn 地址：福建省厦门市厦门大学翔安校区黄朝阳楼D102 电话/传真：0592-2186630 邮编：361002 然后用1倍beads体积的8M尿素（8M尿素，0.1M Tris PH8.0，现配现用），室温下洗脱5min，取上清。这种洗脱方法在用M2 beads IP带3xFlag标签蛋白时洗脱效果不理想；样品加入8M尿素后，样品温度不能超过30°C，温度过高易引起Carbamidomethylation等修饰影响鉴定效果。（由于不同的抗原抗体结合强度差异很大，所以，用该方法直接从Beads上洗脱的效果会有很大差异，采用该方法前请进行预实验以验证该方法的有效性）B. 如果溶液样品不是用8M尿素溶解，请提供IP的详细操作步骤（包括每一步所用Buffer的配方）。C. 如果样品中含有SDS，TritonX-100，Tween-20，NP-40，CHAPS，PEG，甘油等会掩盖样品质谱信号的物质，实验证明所得结果一定不好，必须在申请单上注明； ? 样品以粉末方式送样：IP洗脱后的样品体积大，蛋白量较多（大于50 ug），可以用TCA （三氯乙酸）将蛋白质沉淀，然后用预冷的丙酮将沉淀清洗三次，每次用1 mL预冷的丙酮清洗，干燥后，样品以粉末方式送达（必须注明样品在用丙酮或TCA沉淀前的溶液成分，是否含有SDS，TritonX-100，Tween-20，NP-40，CHAPS，PEG，甘油等）。 ? 以胶样品送样：IP后跑胶后根据条带强弱分成若干组分切下送样分析（胶样品请参考注 意事项4）； 8. 全细胞裂解液/组织提取液：（最好用8M尿素裂解细胞，刮下后冰上超声裂解细胞（超5下停20秒，等超声探头温度下降后继续超声，不可一次长时间超声导致温度超过30°C，引起蛋白Carbamidomethylation修饰。 组织样品经液氮研磨后，用8M尿素超声裂解。） ? 溶液样品需注明溶剂成分 ? 蛋白量尽量估计准确； 9. 翻译后（磷酸化）修饰鉴定： ? 磷酸化修饰鉴定请注明：A. S+T磷酸化，Y磷酸化或者S+T+Y磷酸化; B.如果只鉴定某 个蛋白磷酸化，请注明所要鉴定磷酸化蛋白的基因名字和accession number； ? 简单样品（胶样品，IP样品等）请提供尽量多的目的蛋白（> 1 ug）； ? 复杂样品（全细胞裂解液，组织提取液等），请提供至少5mg蛋白； 10. 肽指纹图谱（蛋白测序）： ———————————————————————————————— 厦门大学生物医学仪器共享平台 网址：http://121.192.179.197 电邮：bio-center@xmu.edu.cn 地址：福建省厦门市厦门大学翔安校区黄朝阳楼D102 电话/传真：0592-2186630 邮编：361002 ? 要求样品纯度高，样品量>2ug； ? 打肽指纹图谱，请提供序列，同时发电子版申请单至wuyy@xmu.edu.cn或 xiechch@xmu.edu.cn。 11. 复杂样品定量（label-free 定量，iTRAQ标记定量或者双甲基标记定量）: 样品溶解在 8M尿素溶液中，测浓度后，每个样品请取200 ?g送测，剩余样品请自行保存。 12. 检测申请单填写说明（按照样单填写） ? 带有*号标记的项必须填写。 ? 物种来源：填写所送样品所属物种的学名，例如：所送样品是人源p62，就填写Homo sapiens；在小鼠细胞中转染人源p62，IP p62想要鉴定p62相互作用蛋白时，物种来源，请填写Mus musculus。 ? 样品名称：只能使用英文字母+阿拉伯数字对样品命名，不能使用中文，不要仅仅使用1、 2、3、4...和A、B、C、D...，最好用名字的首字母+编号，不能超过6个字母，送样单上的样品名称必须与样品管上一致，如：李四送了四个样品，可以把样品名称写成LS-1，LS-2，LS-3，LS-4。 ? 单位名称：校内单位请填写各学院名称，校外请填写具体的全称。 ? 同一张检测申请单里的样品检测目的要一致；如果检测目的不一样，请分别用不同的检 测申请单填写。 ? 以上注意事项请务必严格遵守！因忽略之导致实验结果不理想，本中心概不负责。 文中提到的溶液配方： 8M尿素：尿素溶解在0.1 M pH8.0 Tris缓冲液中。 脱色液：40% 乙腈（ACN），50 mM碳酸氢铵（ABC）in H2O 发文章时，如有用到本中心所给的数据，请务必在文中致谢厦门大学生命科学学院分析测试中心（We thank Dr. C.C. Xie and Yaying Wu for mass spectrometry experiments and anslysis.），并通知我们，以便我们统计和评估工作成果，进而不断提高服务水平。 ———————————————————————————————— 厦门大学生物医学仪器共享平台 网址：http://121.192.179.197 电邮：bio-center@xmu.edu.cn 地址：福建省厦门市厦门大学翔安校区黄朝阳楼D102 电话/传真：0592-2186630 邮编：361002