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百合的组织培养
一、百合叶片的组织培养
(一)外植体
百合鳞茎。 (二)灭菌方法
取百合花茎于洗涤灵液中浸泡20min, 自来水冲洗20 min, 离花茎叶片基部上下各0.2cm 左右, 剪取0.5cm 带叶片茎段。自叶片基部留叶片长1.5~ 2.0cm, 剪去以上大部叶片, 于0.1% 农用链霉素水溶液中浸泡1h, 自来水冲洗20 min; 无菌条件下, 75% 酒精处理2~ 3s; 0.1% 升汞溶液处理3~ 4 min, 无菌水洗5~ 6 遍, 备用接种。 (三)发育途径
将叶片茎段接种于诱导分化培养基, 待诱导出芽后将芽接种于增殖培养基, 最后增殖芽进行生根诱导。 (四) 培养基
以MS 和LS 为基础培养基, 细胞分裂素采用BA, 生长素采用NAA, 以二者不同浓度和比例制成诱导分化培养基和芽增殖培养基, 探求基础培养基MS 和LS 及不同浓度激素及其配比对新普百合诱导分化和不定芽增殖的效果。生根培养基采用LS, 培养基中添加不同浓度生长素、活性炭, 研究生长素浓度及活性炭对生根苗的影响。培养基均添加琼脂7g / L。在103kPa、121℃条件下灭菌15min。
(五)培养条件
培养室温度( 25±1℃) , 相对湿度60%~ 70% , 光强1800~ 2500lx , 光照每天12h。 (六)讨论
愈伤组织的诱导及不定芽的分化设计8 种起始诱导培养基, 每种培养基接种50 片叶。接种后, 在适宜培养基上, 15 天左右可见叶片基部膨大隆起, 继而生出黄绿色愈伤组织,20 天左右可长至0.5cm3 , 并生出绿色芽点后分化出芽, 50 天左右可长至2~ 3cm。统计愈伤组织及不定芽诱导状况。结果表明, 经50 天的培养后, 单一使用细胞10分裂素的处理效果不佳, 愈伤组织诱导率、不定芽分化率均较低。因此在新普百合的诱导培养中需细胞分裂素( BA) 和生长素( NAA) 配合使用。当BA 浓度较高时, 有利于愈伤组织的形成, 不利于不定芽的分化。BA 为2 mg/ L 时,诱导率较高, 分别为78% 和86%, 不定芽分化率则较低, 分别为33% 和49% 。BA 浓度较低( 0", 5mg / L) 时, 愈伤组织诱导率较低, 而不定芽诱导率却相对较高。当BA 为1 mg/ L、NAA 为0. 5mg/ L 时,愈伤组织诱导率、不定芽分化率分别为70%、65% , 处理",分别为84%、80% 。结果得出, 在相同激素水平上, LS 为基础培养基的愈伤组织诱导率、不定芽分化率均好于MS 为基础的培养基。其最佳诱导分化培养基为: LS+ BA 1mg/ L + NAA 0", 5mg/ L, 叶片基部带少许茎段材料,可极大地提高诱导效率和诱导质量。接种材料完全为叶片时诱导率较低, 效果较差。 (七)参考文献
王志 朱万芹 李风忱 新普百合叶片的组织培养 山东农业科学, 2005年, 第5期
二、百合鳞茎的组织培养
(一)外植体
东方百合鳞茎内层鳞片。 (二)灭菌方法
将用作外植体的鳞茎用自来水冲洗干净后, 去掉外层鳞片, 一层层剥离内层鳞片。在超净工作台上先用75% 酒精棉球擦拭鳞片表面, 再用0. 1%HgCl2 消毒10 min, 然后用无菌水洗4 ~ 5 次, 接种于( 1) 号培养基上, 较大的鳞片可切成几小块。 (三)发育途径
丛生芽的诱导，鳞片在培养基上首先分化出浅绿色的愈伤组织，约一个月后愈伤组织上分化出淡绿色的丛芽，丛芽继续生长约半个月后绿色叶片展开，将外植体切成带3~4个芽的小鳞片，转到培养基上进行增殖培养。将丛生芽切分成单芽，接种到培养基上后，丛生芽逐渐分化，约一个月后形成深绿色鳞片紧包的小鳞茎。
(四) 培养基
鳞片诱导从芽和增殖培养基: N6+ 6-BA 1. 0~ 2. 0 mg/L ( 单位下同) + NAA 1. 0;( 2) 生鳞茎培养基: MS + 6-BA 1. 0~ 2. 0+ PP333 1. 0~ 3. 0+ NAA 0. 05~ 0. 1; ( 3) 生根培养基: MS+ IBA 0. 1 ~ 0. 2。所有培养基均附加0. 7% 琼脂和3% 的蔗糖, pH 5. 8 ~ 6. 0。 (五)培养条件
培养温度( 25 ±2)℃ , 光照12 h/d, 光照度2 000 lx 左右。 (六)讨论
丛生芽的诱导及增殖培养", 鳞片在培养基( 1) 上10~ 15 d 后开始膨大增厚, 继而周围出现浅绿色颗粒状的愈伤组织, 约1 个月后, 从愈伤组织上分化出淡绿色的丛芽, 并逐渐长高。丛芽生长约半个月绿色叶片展开后, 将外植体切成带3~ 4 个芽的小鳞片, 仍旧转接到培养基( 1) 上进行增殖培养。10~ 15 d 后每块小鳞片又可分化形成丛芽, 增值系数3~ 4, 1 个月可继代培养1 次。4. 3 ", 小鳞茎的诱导", 将生长1 个月的丛芽切分成单芽, 接种到培养基( 2) 上, 10 d 后底部开始部分愈伤化, 上半部叶片开始变黄枯萎, 下半部颜色逐渐变深、变肥厚, 并且向内包紧( 图1) , 约1 个月后叶片完全干枯形成深绿色鳞片紧包的小鳞茎。4. 4 ", 生根培养与移栽", 将完整小鳞茎取出, 切除周围杂乱组织和枯叶, 接种到培养基( 3) 上。约15后开始生根, 生根率100%, 待30 d 后形成丛根且根长至1 cm 左右开始炼苗,炼苗7 d 左右, 即可移栽。移栽时, 小心洗去附着在根上的培养基, 将苗移入由珍珠岩、蛭石和腐殖土1", 1", 1混合而成的移栽基质中, 浇透水, 盖上塑料薄膜, 晴天每天早晚各喷水1 次, 约2 周后新根长出即可成活, 成活率达98% 以上。 (七)参考文献
庄志鸿 刘建 试管内形成东方百合鳞茎的组织培养 植物生理学通讯 第38卷，第二期，2002年4月
三、百合茎尖的组织培养
(一)外植体
麝香百合茎段 (二)灭菌方法
初夏将其新抽出的嫩枝剪下, 切去叶片, 用自来水冲洗干净, 在无菌条件下先用无水乙醇浸渍极短时间, 然后放入",", 漂白粉过滤液中消毒",", 分钟, 无菌水冲洗", 一", 次, 然后在叶片着生部位卜切成一厘米长的茎切段, 用镊子将茎段竖着插入予先准备好的培养基中 (三)发育途径
茎段接种后均能从切口周围产生半透明的愈伤组织, 随后转为淡黄绿色, 少数则从节处产生淡黄绿色的小芽约50天后茎段切口周围的愈伤组织变成黄绿色并具有芽的突起, 芽突不断分化, 先出现许多绿点, 随后绿点间上长出叶片。70天后少部分芽的下方有少许的自色根出现。。从茎段节处出现黄绿色小芽突, 而切口愈伤组织无多大的增殖, 随后芽分化, 形成具有根叶的小鳞茎每节处也能分化长成绿色的小鳞茎2~4个, 并具有根和叶片的完盛植株。 (四) 培养基
基本培养基为MS、SH。为了不同的目的, 在基本培养基中分别加入不同的附加物如NAA(萘乙酸)、IBA（吲哚丁酸）、KT(激动素)、BA(6—苄基嘌呤)、CM9椰乳)。培养基中的蔗糖为3％ , 琼脂为0.6％。培养基的pH在灭菌前用NaOH调至5.7，分装于试管或三角瓶中，在1.5磅／平方时压力下灭菌15分钟。 (五)培养条件
在无菌条件下, 将茎切成1.5厘米长的茎段,竖立插入培养基中, 在室温18~24℃条件下,每天光照9~10小时（白天太阳光照）, 光照度1200~1500勒克司。 (六)讨论
愈伤组织的诱导与形态发生茎段接种后25天,从切口周围产生半透明的愈伤组织, 随后转为淡黄绿色, 少数则从节处产生淡黄绿色的小芽（约绿豆大）。50天后茎段切口周围的愈伤组织变成黄绿色并具有芽的突起，芽突不断分化，先出现许多绿点，随后绿点向上长出叶片。
愈伤组织的分化与长成完整植株。在原培养基中的康香百合茎段切口周围 的愈伤组织, 一直保持不断增殖和分化, 70天后少部分芽的下方有少许的白色根出现。增殖的愈伤组织约3立方厘米大, 每瓶可获得十几株具有鳞茎和绿叶的小苗。从茎段节处出现黄绿色小芽突, 而切口愈伤组织无多大的增殖, 随后芽分化, 形成具有根叶的小鳞茎每节处也能分化长成绿色的小鳞茎2~4个, 并具有根和叶片的完盛植株。
麝香百合能在同一次附加NAA+TBA的MS培养基中培养,不通过继代培养均能诱导愈伤组织的产生,同时又能分化出芽, 在迅速增殖的同时又不断分化出苗的现象。对正在增殖和分化的愈伤组织的观察表明, 愈伤组织块具有从各个方向发生分化, 形成大量的芽原基。因此,可认为麝香百合的组织培养, 是快速无性繁殖的较好途径。若经过多次继代培养, 并再补加6—苄基嘌呤或KT(激动素), 则效果更佳。经组织培养后康香百合的繁殖系数成倍的增加", 一段茎段在一个周期内能获得10多个新生植株, 若多次继代培养, 可得到100 株左右的新生植袜。因此利用嚼香百合茎段进行组织培养是在校短的时间内快速无性繁殖的有效方法。
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(七)参考文献
李耿光、张兰英, 麝香百合茎段组织培养快速繁殖。云南植物研究 5（3）：327—331，2003 。