发布时间 : 星期六 文章杂交瘤技术基本程序与方法更新完毕开始阅读3261d708ba1aa8114431d9bc
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。即复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。用5-10ml HT培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔细胞进行培养。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
6、单抗特性的鉴定
（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 ①杂交瘤细胞的染色体分析
对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下：
a. 在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。
b. 秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1-0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min 10分钟，弃上清。
c. 加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。
d. 向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。
e. 加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。
f. 取出离心管，1000r/min 5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。
g. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。
h. 镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。 ②抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定
抗体的类和亚类对决定提纯的方法有很大的帮助。除采用特殊的免疫方法和检测方法，最经常得到的单抗是IgM和IgG，分泌IgE的杂交瘤细胞很少见，而分泌IgA的杂交瘤通常只有在用于融合的淋巴细胞来自肠道相关淋巴组织才能得到。如在抗体检测中使用葡萄球菌A蛋白试剂，则不可能得到IgG以外的其他类的抗体。鉴定单抗Ig类和亚类的方法主要有两种，一种是免疫扩散，另一种是ELISA。
（A）免疫扩散法
这种方法简便、准确，最常用。被检的McAb样品通常为杂交瘤细胞培养上清液，由于其中单抗的浓度较低，应先将其浓缩10-20倍左右再检测。小鼠腹水中的单抗浓度虽很高，但也含有小鼠本身的各类Ig，它们也会与相应抗血清发生反应，使鉴定结果出现混乱，即使将腹水稀释10-20倍后再检测也不能完全避免上述情况的发生，因此一般不用腹水型单抗作为被检样品。
材料：
a、小鼠IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。
b、0.06mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液（PH8.6）。
c、1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖加入100ml 0.06ml/L PH8.6巴比妥钠-盐酸缓冲液中，隔水煮沸溶解，加0.02% NaN3防腐，4℃保存备用。
d、洁净载玻片，打孔器（直径3mm），湿盒，酒精灯。
方法：
a、杂交瘤细胞培养上清液的浓缩：取该上清液10ml装入透析袋中，用线扎紧，放在小烧杯中，透析袋周围堆置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone），放于4℃数小时，待透析袋内液体量浓缩至约0.5-1ml时，吸出，可于-20℃保存备用；也可采用吹
风蒸发浓缩。
b、加热溶化1%琼脂糖凝胶，铺制琼脂糖板，每片约3ml。
c、待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周围6孔），然后封底。
d、向中央孔加入抗小鼠IgG类或亚类抗血清，周围孔加入待检样品；加样后将琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中12-24小时或4℃过夜，观察结果。
（B） ELISA法
该法不需要将样品浓缩，而且比免疫扩散法更快地得到结果。
材料：
a、ELISA所需用溶液同杂交瘤细胞的筛选一节。
b、酶标板。
c、山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig类及亚类特异性血清；HRP结合的山羊抗兔Ig等。
d、待检杂交瘤细胞培养上清；阴性、阳性对照样品。
方法一：
a、每孔加入适量的100ul山羊抗小鼠Ig，室温2小时；洗涤液洗2次。
b、每孔加200ul封闭液，室温作用1小时。
c、洗涤液洗2次；加100ul杂交瘤细胞培养上清，4℃过夜；设阴性、阳性对照孔。
d、洗涤4次，每孔加100ul兔抗小鼠Ig类及亚类特异性抗血清，室温2小时。
e、洗涤4次，加100ul HRP标记的山羊抗兔Ig；室温作用2小时。
f、洗涤后，加底物显色，判读结果。
g、若有HRP标记的抗小鼠Ig类及亚类试剂，则可省去e。
方法二：
a、以适宜浓度的抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。
b、洗涤后，加入待检的单抗样品，100ul/孔，37℃ 1小时；设阴性、阳性对照孔。
c、洗涤后，加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂，100ul/孔，37℃避光显色15分钟；用2mol/L H2SO4终止反应后，阅读各孔的OD490值。
C、单抗纯度的鉴定
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB的原理和方法请参阅有关专著，这里不再赘述。
（1）单抗理化特性的鉴定
从实用意义上说，单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。其中单抗亲合力测定比较复杂，下面作简要介绍。
抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。
单抗亲合力测定是十分重要的，它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。在建立各种检测方法时，应选用高亲合力的单抗，以提高敏感性和特异性，并可节省试剂。而在亲和层析时，应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂，因为亲合力过低不易吸附，亲合力过高不易洗脱。
精确测定单抗的亲合力是较困难的，好在实际应用中选择单抗时，通常只需测定各单抗的相对亲合力及其高低排列次序。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA 、间接ELISA、间接法夹心ELISA等，这里仅介绍竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其步骤是：
取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。洗涤后，加入封闭液（0.5% BSA-PBS，PH7.2）100ul/孔，37℃ 1小时。取一定浓度的单抗，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡；必须注意所用抗原浓度至少要比抗体浓度高10倍以上。将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中，100ul/孔，37℃ 1小时。洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记抗小鼠IgG抗体，100ul/孔，37℃ 1小时。洗涤后，加入底物（OPD）溶液，100ul/孔，37℃显色15分钟；2mol/L H2SO4终止反应后，于495nm波长测定各孔的吸收率（A）。按下列公式计算各单抗的亲和常数（K）：
A0/（A0-A）=1+K/a0
其中A0=无抗原时A值；A=采用不同浓度抗原时的A值；a0=抗原总量；K=亲和常数。
（2）单抗与相应抗原的反应性测定
单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位，确定单抗针对的表位在抗原结构上的
位置，是单抗特性鉴定的关键环节，同时，进一步分析这类表位的差别，可正确评价单抗的特异性和交叉反应性，如一些抗原为同属不同血清型共有，甚至是科内不同属所共有，而另一些抗原表位则是某种血清型乃至某一菌株或毒株所特有。此外，单抗的反应性往往呈现一种或几种免疫试验特异性，这在建株时予以测定，有利于正确使用这些单抗。
单抗反应性测定的方法很多，包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等，选择何种方法依据不同的单抗特性和试验目的而定，请参阅有关论著的详细论述。