发布时间 : 星期二 文章第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体更新完毕开始阅读3ee94f4de518964bcf847c0e
4 个组成部分，简称lacZOPI片段。 *HindII片段=lacZOPI片段
*由上述可见M13-HindII片段上不带有功能性的阻遏基因。所以在被感染的细胞中，?-半乳糖苷酶的合成将是组成型的：
因为当M13噬菌体颗粒感染了E.coli细胞之后，很快就会累积约200个RF DNA/cell；假若其上带有HindII片段，那么普通的lac+细胞的阻遏状态将会随着HindII片段的复制而得以消除；这是因为每个细胞中都仅存有10个左右的阻遏物分子的缘故。结果在感染的细胞中，lac结构基因的转录活动便属于组成型的。 *从组成型到诱导型的改造
为了克服这种组成性，已将lac阻遏基因的Iq突变引入寄主细胞。这个Iq突变基因可以产生出十余倍超量的阻遏物，所以这种突变的存在，寄主细胞就能合成出充足的阻遏物去补偿大量的M13 RF DNA分子。在具有lacIq突变基因的寄主细胞中，给lac操纵子加入一种诱导物，典型的是IPTG，就可以激活HindII片段的复制。
IPTG分子结构式
IPTG的作用：
*是一种含硫的乳糖类似物。IPTG：isopropylthio-?-D-galactoside异丙基硫代-?-D-半乳糖苷。
*这种类似物在没有乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成?-半乳糖苷酶。所以我们称IPTG为?-半乳糖苷酶的安慰诱导物(gratuitous inducer)，亦即不发生代谢变化的诱导物。 *在X-gal显色反应中，?-半乳糖苷酶同样也需要诱导，但X-gal不是一种诱导物，所以得在琼脂平板上加入IPTG。 JM101寄主菌株(及其它类似菌株)：
在M13克隆体系中常用JM101菌株作寄主，该菌株染色体上的lacZ基因已经缺失了，但在它携带的F质粒上有一个M15基因和lacIq突变，这有两个方面的作用：
*第一，可以产生出超量的lac阻遏物，这就使得lac操纵子的表达置于培养基中渗入的IPTG的调控之下。
*第二，当M13载体感染之后，通过?-互补作用，便会形成有功能活性的?-半乳糖苷酶。在补加X-gal及IPTG的培养基中，就会出现蓝色的菌落。
3．M13载体系列的发展
M13噬菌体要发展成克隆载体。着选必须鉴定出可用来克隆外源DNA的非必要区段，然而它似乎不存在这种区段。 *特殊区段的发现——M13唯一的基因间区段的发现。
该区段位于Gene2和Gene4之间，长507核苷酸，(5498-6005)
该区段上存在着M13 DNA复制起点，但就噬菌体的发育功能而言，并不要求保持该区段的完整性。
*M13 mp1载体的获得
在M13唯一的基因间区段内有一个BsuI位点，将乳糖操纵子的HindII片段克隆在该位点上，获得了M13mp1载体。M13载体系列命名为MBmpn。其中n为整数，如M13mp8，M13mp9等。 *M13mp2载体的获得——EcoRI位点的引入
M13mp1载体的获得在M13载体发展工作中占有十分重要的地位，随后出现的一系列M13载体都是在它的基础上经改建派生出来。
该载体缺点是克隆位点少，只有AvaII、BglII和PvuI三个单克隆位点。因此改建的重点是增加克隆位点。
在M13mp1的?-半乳糖苷酶?-肽链的第五个氨基酸密码子及其附近有一段GGATTC序列。经突变获得GAATTC，即EcoRI识别序列。(G→A碱基转换过程。见P.185-186) *M13mp7载体的获得——衔接物多克隆位点的引入
把化学合成的衔接物加入到M13mp2克隆载体的EcoRI位点上，产生出了适用于多种核酸内切限制酶的单克隆位点的新的M13系列克隆载体，即M13mp7。但这段寡核苷酸短片段(即衔接物)的加入，总共为?-半乳糖苷酶基因增加了14个额外密码子，然而这并不影响此多肽进行互补作用的功能。 *限制位点非对称排列的多聚衔接物的引入
M13mp7载体带有一段由非对称排列的多种限制位点组成的多聚衔接物区域：
图
这种结构的一个明显缺点是当用两种限制酶(例如EcoRI-SalI)切割时，将会产生出一种具有由远端限制酶(EcoRI)所形成的相同