发布时间 : 星期三 文章大豆异黄酮的测定方法综述(精)更新完毕开始阅读3f95b7c6dc88d0d233d4b14e852458fb770b3880
三波长法于 1980年 – 经提出, 便很快在岛津 UV – 250分光光度计上被采用, 形成 – 种新方法。该法原理为:根据大豆异黄酮在 240nm 、 260nm 、 280nm 三 个波长处吸光值,分别计算△ A ,计算方法为:△ A=A260-(A240+A280 /2。 根据三角形相似原理推得△ A 与待测物浓度成正比, 进而求得待测物质浓度。 鞠兴荣等〔 2〕采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量,有效消除随浓 度不同发生本底漂移、 油脂等干扰物质、 及吸收峰不对称给定量分析造成不良影 响。此法简便、灵敏,最低检出浓度为 1μg/mL,加样回收率>99%;证明该
法具有良好准确性和精密度,适于大批量样品测定和产品生产质量控制及监测。 2根据色谱原理检测方法
2.1高效液相色谱法(HPLC
高效液相色谱法是在经典色谱法基础上, 于上世纪 60年代后期引用气相色 谱理论所建立检测方法, 可广泛应用于大豆异黄酮检测。 在技术上, 色谱柱是以 特殊方法用小粒径且均匀填料填充而成, 小颗粒具有高柱效, 从而使柱效大大高 于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万 ,但会对仪器产生高阻力,为 此,流动相改为高压输送(最高输送压力可达 4.9×107Pa ;同时,柱后联有高 灵敏度检测器, 可对流出物进行连续检测。 与 HPLC 配备的检测大豆异黄酮仪器 主要是紫外分光光度仪(UV 和质谱分析仪(MS 。
建立高效液相色谱法 (HPLC 测定保健食品中大豆异黄酮含量方法。 运用二 极管阵列检测器(PDA 建立 4种大豆异黄酮组分:染料木素、大豆苷元、黄 豆黄素和黄豆苷光谱库, 采用 PDA 检测, C18反相柱, 以甲醇∶ 水∶ 醋酸 (HAC =55∶ 45∶ 1(V/V/V为流动相,测定 4种大豆异黄酮组分响应值之比。该法变 异系数小于 5%,回收率在 92.5%~99.3%之间,检测速度快,精密度及准确度 在允许范围内,可作为测定保健食品中大豆异黄酮方法。
超声波辅助提取(UAE 可提高有机化合物提取有效率,徐颖〔 3〕采用高 效液相色谱法结合具有提取时间短和工艺简化等优点超声提取法测定异黄酮含 量。吴周和等〔 4〕建立反相高效液相色谱法测定豆制品中大豆苷元和染料木素 方法,采用
Hypersil BDS C18(250mm ×4.6mm ID , 5μm 色谱柱,以甲醇、 0.5%乙酸水溶液为流动相, 流速为 1ml/min, 柱温为 35℃, 检测波长为 260nm ; 样品制备经真空干燥、正己烷脱脂、 80%甲醇加热提取、离心、过滤等过程, 大豆苷元和染料木素加样回收率分别为 99.1%和 98.8%, RSD 分别为 1.3%和 0.5%。
2.2高效液相色谱―质谱法(HPLC – MS
高效液相色谱―质谱法是 HPLC 与 MS 相结合检测方法, – 般 – 级 MS 是对 从 HPLC 中出来所有物质进行质谱分析,也就是包括 HPLC 谱图中所有峰;二 级 MS 是将通过 – 级 MS 得到带电离子进 – 步击碎,这样可得到更多分子结构信 息,可对物质进行进 – 步结构定性。该法检测大豆异黄酮最大优点是能迅速、准 确确定液相色谱图中各色谱峰归属,还可解决因标样缺乏而造成定性分析难题。 HPLC – MS 主要适于临床上大豆异黄酮代谢产物分析〔 5~6〕 。
2.3气相色谱法(GC
气相色谱法是 – 种物理分离方法,利用被测物质各组分在不同两相间分配系 数(溶解度微小差异,当两相作相对运动时,这些物质在两相间进行反复多次 分配, 使原只有微小性质差异产生很大效果, 从而使不同组分得以分离。 孙艳梅 等〔 7〕采用气相色谱法,选取 ATSE – 30毛细管柱,在柱温为恒温 260℃时, 测黄豆苷元保留时间为 21min ,确定出黄豆苷元标准工作曲线方程为 Y=71519x -85913,相关系数 R2=0.99370。精密度研究发现,连续进样 6次,标准方差 (SD 小于 7%。
2.4气相色谱―质谱法(GC – MS
气相色谱―质谱法是气相色谱法延伸, 定性能力更强, 是用气相色谱法分离 并定性与用质谱法定性相联用分析方法。 该法广泛应用于研究血浆、 尿液及粪便 中大豆异黄酮体内变化〔 8〕 ,及蔬菜和坚果中大豆黄素含量测定〔 9〕 。
2.5毛细管电泳法(CE
毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上差异而实现分离的电泳分离分析方法。 该法作为 HPLC 替代方法, 已用于多种化合物测定, 逐渐成为测定植物雌激素 (尤 其是大豆苷元和染料木素常规方法之 – ,该法也是分离检测大豆异黄酮最为先 进 – 种方法。 Vanttinen 等〔 10〕采用毛细管电泳法对处理过大豆粉和豆腐中大豆 黄素等异黄酮成分进行测定。 Mcleod 等〔 11〕采用毛细管电泳法对食物中大豆 黄素和金雀异黄素的电离常数进行测定, 系统采用石英玻璃毛细管柱, 单波长紫 外检测器, 检测波长为 210nm , 两样品测定间用 1mol/LNaOH 洗脱 5min , 去 离子水洗脱 3min ,测试用电解质洗脱 5min 。
2.6薄层扫描色谱法(TLCS
薄层扫描是薄层色谱定量方法, 可检测大豆异黄酮单体组分, 它利用各组分 对同 – 吸附剂吸附能力不同,使在移动相(溶剂流过固定相(吸附剂过程中, 连续产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,从而达到各组分互相分离目的。此 法可对大豆异黄酮单体成分进行检测, 但其薄层显色剂用量很难准确控制。 赵世 萍等〔 12〕报道葛根中异黄酮成分含量薄层光密度测定法。用甲苯―甲醇― 10%甲酸(7∶ 3∶ 0.02和乙酸乙酯―甲醇― 50%甲酸(8∶ 2∶ 0.2为展开剂,在硅 胶 G 薄层上分离大豆苷元、大豆苷、葛根素和大豆苷元– 4′, 7′–二葡萄糖 甙, 并用 CS – 910双波长薄层扫描仪进行定量测定,变异系数为 1.5%~1.6%,可 采用该法测定生药和片剂样品中含量。
2.7四标样快速测定法
四标样快速测定法需要四个不同标准品,并分别制作标准曲线,然后根据 G=(Cge +Cde +Cg +Cd ×10/W计算,其中 G 为样品中大豆异黄酮百 分含量, W 为样品称样量(mg , Cge 、 Cde 、 Cg 、 Cd 分别为样品中染料木素、 大豆苷元、 染料木苷、 黄豆黄苷四种组分出峰面积折算为标准品毫克量。 该法可 准确定性、定量检测大豆异黄酮粗提物纯度,且样品处理简单、操作容易,特别 适于生产中物料快速检测,以便及时控制生产工艺参数。何继春等〔 13〕采用高 效液相色谱仪, C18
反相柱 (4.6mm ×250mm , 5μm , Waters515泵, Waters2487双波长检测器;流动相:甲醇∶水 =95∶ (5V ∶ V ,流速:1ml/min,柱温:35℃, 检测波长:260nm ,进样量:10μm ,灵敏度达 0.02AUFS 。
2.8双向纸层析色谱法(Two – dimensional paper chromatography
该法以纸为载体色谱法, 可对 ISO 进行定性测定。 固定相 – 般为纸纤维上吸 附水分, 流动相为不与水相溶有机溶剂; 也可使纸吸留其它物质作为固定相, 如 缓冲液, 甲酰胺等。 将试样点在纸条 – 端, 然后在密闭槽中用适宜溶剂进行展开, 当组分移动 – 定距离后,各组分移动距离不同,最后形成互相分离斑点。在没有 高效液相色谱仪条件下,双向纸层析色谱法也是 – 种较为理想定性分析方法,该 法能很好了解异黄酮提取工艺中每 – 个流程中异黄酮变化。彭义交等〔 14〕采用 双向纸层析色谱法对大豆粕甲醇提取液中大豆异黄酮组分进行分析, 并对吸收峰 面积在 1%以上组分进行液相色谱―质谱(LC – MS 分析,其苷元与纸层析色 谱结果基本吻合。
3根据医学免疫检测方法
3.1时间分辨荧光免疫分析法(TR – FIA
时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物 (代替荧 光物质、同位素或酶 ,标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性 细胞,待反应体系(如:抗原抗体免疫反应等发生后,用时间分辨荧光仪测定 最后产物中荧光强度, 据此判断反应体系中被测物质浓度。 该法主要用于医学上 检测生物体血液和尿液中大豆异黄酮,但该法具有抗体不易制备缺点。 Uehara 〔 15〕 等通过时间分辨荧光免疫分析法对人尿样中植物雌激素 (包括黄豆苷和染 料木苷进行快速分析。
3.2酶联免疫吸附法(ELISA
ELISA 是 – 种经典免疫测定方法,主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体 表面并保持其免疫活性, 抗原或抗体与酶形成酶结合物仍保持其免疫活性和酶催 化活性基本原理。其主要试验步骤可概括为包被、洗涤、与特异性抗体反应、与 酶抗抗体反应、 显色和测定, 根据颜色反应深浅进行定性或定量分析。 Creeke 等