发布时间 : 星期二 文章年产6000吨木聚糖酶发酵车间的设计更新完毕开始阅读414888ab5901020206409c10
坚硬的半纤维素、果胶等物质组成的细胞壁所包围，如果对其用含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶的酶制剂来处理，就可在比较温和条件下使组织柔化，使细胞破壁，将有效物质充分提取出来。与此同时也降低了提取液的粘度，使生产过程中的浓缩、干燥效率成倍提高，相应降低生产成本。
其他应用：据报道，木聚糖酶可与其它酶共同参与使植物降解为戊糖、己糖，再用其它菌株发酵生产乙醇。也有报道发现能把植物纤维直接转化为乙醇的一些菌，如Thermbacteroides acetoethylicus, Clotridium thermosaccharolyticum。另据报道，木聚糖酶在去污洗涤，医药制造，以及在果实成熟、种子萌发、真菌的寄生及植物的抗性等诸多生理过程中都有着重要的应用。
1.1.4木聚糖酶产业发展现状
我国对木聚糖酶的研究主要集中在产木聚糖酶优良菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质的研究等方面。
当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得。根据发酵工艺的不同，可分为固体发酵和液体发酵两种。这两种发酵方式各有其优缺点：固体发酵所用培养基相对便宜，主要以农副产品为主。且操作设备简单，整个生产过程中无废物产生，不存在环境污染问题，产率较高。易于在中、小企业推广应用，目前国内木聚糖酶生产主要采用固体发酵方式。但固体发酵同时也存在不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化等缺点；相比较而言，液体发酵由于是在液态环境中进行，菌体、底物、产物（包括热）均易于扩散，使得发酵能够在均质或拟均质条件下进行。该方法便于在生产过程中进行实时检测、控制，易于扩大生产规模。同时，由于液体输送方便，便于机械化操作，产品也易于提取精制。液态发酵工艺的缺点主要是对设备有一定要求及生产成本较高，技术要求也较为严格。但随着生物技术的发展和木聚糖酶广泛应用，采用液体发酵生产木聚糖酶将成为今后发展方向。
与国外相比，国内在木聚糖酶方面的研究起步较晚，主要集中于海枣曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽孢杆菌、串珠链孢菌、链霉菌、环状芽孢杆菌、碱性假单胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究。目前为止，国内学者报道对木聚糖酶的研究基本上还仅限于对产木聚糖酶天然优良菌株的筛选、酶的纯化和一些酶学性质研究方面，只克隆了少数木聚糖酶基因[27]。由于木聚糖酶具有重要的应用价值以及在生物工程技术的重要地位，现在己经有越来越多的科研人员致力于木聚糖酶的开发研究，如高产菌株的选育、工程菌的构建、优化培养条件、无纤维素酶污染的木聚糖酶等。
1.2巴斯德毕赤酵母简介
5
1.2.1巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母属子囊菌类,为单倍体,由于在其细胞的过氧化物酶体中含有
甲醇代谢途径所必需的酶,如醇氧化酶(alcohol oxidase ,AOX) 、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶等 ,所以可利用甲醇作为唯一碳源和能源。由于巴斯德毕赤酵母能够在简单培养基上高密度发酵生长,所以它最初是作为一种工业的甲醇营养型酵母,主要用来生产单细胞蛋白质。
1.2.2巴斯德毕赤酵母的优缺点
经过二十多年的研究和应用发现,巴斯德毕赤酵母具有以下主要优点:
(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；
(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化；
(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；
(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合； (5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。 它也具有以下缺点: (1)发酵周期长
(2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性 (3)筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵 (4)培养基和培养条件不成熟
1.2.3前景展望
巴斯德毕赤酵母是单细胞低等真核生物, 它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性, 同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统, 还能分泌外源蛋白到培养液中, 利于纯化。近几十年来, 巴斯德毕赤酵母表达系统发展成为一个较为理想的蛋白表达系统。它具有外源目的蛋白表达量高、基因遗传稳定和分泌效率高等优点, 并具有甲醇精确调控的强启动子—醇氧化酶启动子( PAOX )及日臻成熟的高密度发酵工艺, 是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一, 越来越受到人们的重视, 被国内外广泛应用于大量生产外源真核或其他结构较为复杂的原核蛋白。目前, 已经有500多种外源蛋白在该系统中进行了高效表达。
6
第二章 木聚糖酶发酵机理
2.1重组巴斯德毕赤酵母发酵合成木聚糖酶的代谢途径
相对而言，对毕氏酵母的报道比较少且多为非结构模型。由于非结构模型多
采用经验的 Monod 模型描述菌体发酵动力学，在表达菌体干重浓度和蛋白方面精度较差。考虑到面包酵母和毕氏酵母在代谢行为和菌体形态多方面有很大的相似性，因此面包酵母的很多研究成果可以为毕氏酵母所借鉴。本章以 Bellgardt（1983）建立的面包酵母动力学模型为基础，借鉴文献所报道的甘油和甲醇的代谢途径，对毕氏酵母发酵动力学建模。
甘油的主要代谢途径包括磷酸化、糖酵解、三羧酸循环和呼吸链。在甲醇期，甲醇首先被氧化为甲醛，甲醛随后进入分解代谢与合成代谢两个途径。在分解代谢中，甲醛被氧化为甲酸盐和二氧化碳，并以电子NADH的形式释放能量。合成代谢途径与甘油期类似，也包括磷酸化、糖酵解和三羧酸循环等过程。
2.1.1甘油代谢途径
细胞外的甘油进入细胞内部，首先被甘油激酶磷酸化为三磷酸甘油 G3P（Glycerol3-phosphate）。G3P 在三磷酸甘油脱氢酶的作用下被氧化为磷酸二羟丙酮。经过糖酵解过程，磷酸二羟丙酮被分解成丙酮酸（PYR）。丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下被氧化为乙酰辅酶 A（Acetyl-CoA）。通常在没有任何反应限制下，乙酰辅酶 A 直接进入三羧酸循环（TCAcycle），在此过程中会有大量细胞物质合成（如氨基酸、核酸等），同时伴随电子载体（NADH）和能量（ATP）的转换。在代谢过程中，如果溶氧或者丙酮酸脱羧反应速率受到限制，代谢将会进入乙醇发酵途径。此时，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成乙醛（Acetaldehyde），乙醛在醇脱氢酶的作用下生成乙醇。而当上述限制解除后，乙醇又可作为基质被利用，这时，乙醇首先被氧化为乙醛，乙醛进而被氧化为乙酸盐，最后转化为乙酰辅酶 A 进入 TCA 循环。伴随着甘油的代谢途径，也有呼吸链的作用。呼吸链的主要作用是为细胞的生长和维持提供能量。关于甘油期内细胞的合成代谢，在此假定细胞物质小部分由 G3P 转化生成，其余大部分在 TCA 循环中生成。乙醇的生成和消耗过程见图 2.1 中的点框，三羧酸循环和呼吸链分别见图 2.1 中的虚线框。
图 2.1 给出了简化的甘油在毕氏酵母细胞内部代谢途径。
7
图2.1毕赤酵母甘油代谢途径
其中甘油转化为三磷酸甘油：
（2-1）
G3P 的糖酵解方程（2-2）以及G3P 合成细胞物质的方程（2-3）如下：
（2-2）
（2-3）
视发酵罐内溶氧水平或者丙酮酸脱羧反应速率是否受到限制，丙酮酸可能直接进入三羧酸循环或者进入乙醇发酵支链。在我们的实验中，溶氧浓度一直保持在 30％以上，所以溶氧不受限；同时实时测量表明发酵罐内乙醇浓度在 0～0.5 g l-1较低的范围内，为此出于模型的简化，本文忽略乙醇的发酵途径，即去掉图2.1中点框部分，认为丙酮酸直接进入三羧酸循环：
（2-4） （2-5）
8