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农杆菌介导的水稻转化
一． 愈伤组织的培养 1. 愈伤组织的诱导
成熟水稻种子去壳，用70%酒精处理2min，无菌水冲洗2~3次，再用25%次氯酸钠消毒处理15min，无菌水冲洗5~6次，将种子转到灭菌的培养皿上，于超净工作台上吹干。接种到诱导培养基N6AD2.5上，28℃暗培养至长出愈伤组织（10 d左右）。 2. 继代培养
用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上，28℃暗培养10 d。继代培养两次后待用。
二． 农杆菌的转化及培养
1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化，并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中，加入2.5uL pHB质粒，冰浴30min，电击，向电击杯中加入800uL SOC混匀，将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm，振荡培养2h，13000rpm离心5min，去掉大部分上清液，用200uL枪头吹打悬浮，涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上，28℃培养至长出菌落。
2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5，5000rpm离心5min收集细胞，用N6ACO液体培养基重悬。
三． 浸染与共培养
1. 选择生长状态良好的愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡，一般浸染时间为10~30min，浸染时要不是摇动。 2. 倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。
3. 将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6ACO固体培养基上，26℃暗培养2~3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
四． 脱菌与筛选
1. 共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈；
2. 浸泡于含500mg/L Cef 的N6ACO液体培养基中，在摇床上中速振荡30~60min； 3. 弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上，26℃暗培养3周，再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。
五． 分化与生根
1． 预分化：将愈伤组织转入预分化培养基上26℃暗培养10 d。
2． 分化：将预分化的愈伤组织转到分化培养基上，26℃，光照12 h/d，培养至长出小绿芽。
3． 生根：将绿芽转到生根培养基上，26℃，光照12 h/d，直至长出小苗。
六． 培养基的配制
1. 基本培养基N6A：N6 24.1g/L + 水解酪蛋白0.5g/L + 肌醇0.1g/L + 蔗糖10g/L + 琼脂8.0g/L
2. 诱导培养基N6AD2.5：N6A + 2,4-D 2.5mg/L 3. 继代培养基N6AD2：N6A + 2,4-D 2mg/L 4. 共培养基N6ACO：N6A + 2,4-D 2mg/L + As 100uM 5. 筛选培养基：
一筛培养基：N6AD2.5 + Hyg 25mg/L + Cef 500mg/L 二筛培养基：N6AD2.5 + Hyg 50mg/L + Cef 400mg/L 6. 预分化培养基：N6A + KT 1mg/L + NAA 0.25mg/L
7. 分化培养基：N6A + KT 1mg/L + NAA 0.25mg/L + 6-BA 1mg/L + Hyg 25mg/L 8. 生根培养基：1/2 N6A + NAA 0.25mg/L + Hyg 25mg/L + 琼脂8.0g/L + 蔗糖20g/L