发布时间 : 星期一 文章酶工程复习提纲2014 - 图文更新完毕开始阅读44528e48227916888486d7d8
（一）离子交换层析
1、如何根据酶的特性选择离子交换介质？
2、如何根据离子交换介质的特性选择缓冲体系？
（二）凝胶层析操作（装柱、洗涤及洗脱）过程中要注意那些问题？ （三）亲和层析的原理及操作要点
第七章 固定化酶
第一节 概述
一、什么是固定化酶？
通过化学方法将水溶性酶与不溶性载体铰链而形成的不溶性酶称为固定化酶。与天然酶比较，固定化酶具有可多次重复使用、可以装塔连续反应、 纯化简单、 能提高产物质量、应用范围广 等多种优点。
二． 固定化酶的优缺点
优点：
1、同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；
2、固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；
3、稳定性显著提高；
4、可长期使用，并可预测衰变的速度； 5、提供了研究酶动力学的良好模型。 缺点：
首次投入成本高 大分子底物较困难
三、固定化酶的制备原则
? （1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。
? （2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能
使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。
? （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定
的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。 ? （4）固定化酶应有最小的空间位阻。
? （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或
反应液发生化学反应。
? （6）固定化酶的成本适中。 第二节 固定化酶的性质及其影响因素
一、影响固定化酶性质的因素
1． 酶本身的变化：
主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2． 载体的影响
（1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响 二、固定化后酶性质的变化
1． 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。 原因：酶结构的变化空间位阻
2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。
(3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。
（5） 对变性剂的耐受力升高
固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。
c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。 3． PH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象
（2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离
（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 4、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化
（1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km' （一）、各类固定化方法的特点比较: 比较项目 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 吸附法 结合法 交联法 包埋法 较难 强 高 不可能 低 物理吸附 .共价键结合 离子键结合 易 弱 较高 可能 低 难 强 低 不可能 高 易 中等 高 可能 低 较难 强 中等 不可能 中等 底物专一性 适用性 不变 酶源多 可变 较广 不变 广泛 可变 较广 不变 小分子底物、药用酶 （二） 选择方法依据： （1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择 （三）选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2）要有活泼的表面 （3）便于装柱进行连续反应 （四）载体活化的方法 A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法 （五）、固定化后酶的考察项目： （1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。 （2） 考察固定化酶稳定性 （2） 考察固定化酶最适反应条件 第八章 化学酶工程 第一节 酶分子的化学修饰 一、酶化学修饰的定义 用化学试剂对酶的侧链基团进行共价改造，从而赋予酶分子以特殊功能和提高酶的活力的方法，称为酶的化学修饰。 二． 酶的化学修饰原因 1、稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2、作用的最适条件不符。 3、酶的主要动力学性质的不适应。 4、临床应用的特殊要求。 5、酶化学修饰人为改变酶的某些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至是创造出 新的活性，扩大酶的应用范围。 三、酶化学修饰的目的 1、改变活性部位的构象。酶蛋白的主链经蛋白酶的水解作用，去掉部分肽段或者取代蛋白质一级结构上某些氨基酸残基，使活性部位的结构发生改变，以达到人们所需要的各种目的。 2、提高生物活性。酶分子侧链基团的化学转变，改变基团的电化学性质、分子内基团 的相互作用力等，某些情况下能提高酶的生物活性。 3、增强酶的稳定性。一般酶反应条件基本接近中性，但在工业应用上，由于生产条件、底物等带来的影响，作用的pH常常不在中性；生产温度的提高，酶往往易变性失活。这些都直接影响酶作用的发挥。用双功能试剂让酶分子基团之间、内部侧链基团之间进行交联，可以达到提高酶的稳定性的目的。 4、降低酶类药物的抗原性。酶是蛋白质，作为药物使用时，这些异源蛋白进入人体后可能成为抗原，诱导相应的抗体产生，这些酶类药物就会通过抗原抗体反应被清除掉，从而不能发挥药效，有的甚至还会产生过敏反应。通过对酶的化学修饰，可以降低酶类药物的抗原性。 5、改变酶学性质。利用有机小分子或大分子物质对活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，达到改变酶学性质的目的。 四、 酶化学修饰的基本原理 1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 因此，在酶的化学修饰过程中需要注意以下几个方面： （1）、充分了解被修饰酶。开始设计酶化学修饰反应时，对被修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性质及酶反应的最适条件等应尽可能全面了解。 （2）、修饰剂的选择 选择修饰剂时要求修饰剂具有较大的相对分子质量，对蛋白质的吸附有良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面有较多的活性基团，还要考虑修饰剂上的反应基团的活化方式和活化条件，以及修饰后酶活性的半衰期。 （3）修饰反应条件的选择 修饰反应一般要选择在酶稳定的条件下进行，尽可能少破坏酶的必需基团，选择酶与修饰剂的结合率和酶活回收率都较高的反应条件。对反应体系中酶与修饰剂的分子比例、反应温度、pH、时间、溶剂性质和离子强度等在确定反应条件时也必须考虑。 五、 酶修饰方法 （一）、 酶分子侧链基团的化学修饰 （二）、 酶分子表面的化学修饰 （三）、 蛋白质类及其他对酶的化学修饰。 六、 修饰酶的性质及特点 1．热稳定性提高 修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活，增强了酶的热稳定性。 2．抗原性降低 当酶被修饰以后，酶分子表面上许多抗原决定簇在反应过程中被修饰剂结合，在空间结构上使这些抗原决定簇被屏蔽，从而降低了酶分子的抗原性或抗原抗体的结合能力。 3．体内半衰期延长 经过化学修饰后，由于增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及对热稳定性的提高，所以其半衰期都比天然酶长。 4．最适pH变化 修饰酶的微环境更为稳定。 5．酶的动力学性质的改变