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Trizol提取RNA、DNA、蛋白质步骤
1st step RNA的提取
一、材料 食管癌组织。 二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂耗材
1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水(去离子水或MilliQ的高纯水更好)，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、trizol 4、氯仿
5、手套、帽子、口罩
6、1ml、100ul、10ul枪头、1.5ml和200ul EP管（DEPC处理过的） 7、液氮 8、甲醛
1.2 DEPC水配制的3 M，pH5.2 的NaAc：在80 mL DEPC水中溶解40.8 克NaAc.3H20（Amresco 公司），用冰乙酸调pH至 5.2，定容到 100 mL。
1.3 10×甲醛变性胶缓冲液 [10×FA（formaldehyde agarose） gel buffer：200 mM的MOPs，
50 mM的NaAc，10 mM的EDTA]：称 6.8 克NaAc.3H20，溶于 400 mL DEPC处理过的去 离子水中，然后加 20.9 克MOPs溶解，再加 1.86 克 EDTA二水二钠，用 1 M灭菌的NaOH调pH至 7.0（约用NaOH 40 mL）加DEPC处理过的水定容到 500 mL，棕色瓶中室温避光 保存。
1.4 5×加样缓冲液（5×loading buffer）： 先配水饱和的溴酚兰液，在一只 1.5 mL 离心管中加入约 0.1 mg 溴酚兰，加入 1 mL DEPC 水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚兰粉末剩余，上层液体即水饱和 的溴酚兰液。加入以下各种成分： 4.00 mL 10×FA gel buffer 3.84 mL 甲酰胺
2.00 mL 100%的甘油
720.00 μL 37%（约 12.3 M）的甲醛 80.00 μL 0.5 M 的 EDTA（pH8.0）
16.00 μL 水饱和的溴酚兰（若颜色太淡，可以加 40 μL） 100.00 μL DEPC 水
分装 1.5 mL 离心管，除常用的 4℃保存外，其余-20℃保存。 1.5 1×甲醛变性胶电泳缓冲液（1×running buffer）：20 mL 10×FA gel buffer，4.0 mL 37% 的甲醛，176 mL 水。 1.6 1.2%的甲醛变性胶：称 0.4 克琼脂糖，加入 3.34 mL 10×FA gel buffer，加 30 mL DEPC
水，微波炉融化，冷至约 60℃，加 0.6 mL 37%的甲醛，倒入 7.5×5.0 cm 的凝胶模具中。 四、操作步骤
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA 可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、戴手套、帽子、口罩、3%双氧水浸泡电泳槽、量筒、制胶槽梳子30min。高速离心机遇冷。
2、食管癌组织及近旁组织称重，各取100mg组织。
3、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，移至2mL玻璃套管中（DEPC处理过的），冰上匀浆20次后，移入1.5mL EP管中，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒,12000g 10min。 3、取上层水相于一新的离心管，（有机相及中间层保存待用）按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟（15分钟更好也可放-20度30分钟），12000g离心10分钟。 4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA定量并电泳检测。
6、RNA可进行反转录合成cDNA，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
7、一般取0.5 μg 的 RNA，加入 1/5 体积的 5×加样缓冲液，65℃加热 5 min，冰上骤冷，以消除 RNA 的二级结构。建议在 RNA 样品中加入 1.0 mg/mL 的溴化乙锭（EtBr），而不在胶中加 EtBr，这样电泳后的背景较低。配好的 1.2%的甲醛变性胶先在 1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳 15-30 min。RNA 样品在 3-5 V/cm 的电压降下电泳 2 h。
2nd step DNA的提取
一、材料
RNA提取步骤2中的有机相及中间层
二、设备
冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，PH计，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂耗材
1、乙醇：取干净50 mL摇菌管，分装40mL无水乙醇。（并标注trizol DNA用乙醇和日期） 2、 0.1M柠檬酸钠（10%乙醇）：将40 mL×柠檬酸钠分子量×0.1M÷1000= g溶于30mL 10%乙醇，并定容至40 mL。
3、 75%乙醇：取干净50 mL摇菌管，加入30mL无水乙醇和10mL去离子水混合。（并标注trizol DNA用75%乙醇和日期）
4、 8mM NaOH：取0.1g NaOH溶于40mL去离子水配置成100mM NaOH母液，取2mL 100mM NaOH母液溶于23mL去离子水中。
四、操作步骤
1、样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。 2、移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml 0.1M柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。
3、用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。
4、室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mM NaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。 5、DNA定量：Nanodrop定量
6、取2ug DNA 0.7%凝胶电泳（DNA mark landa Hind Ⅲ 5uL 作为参照）。
五、备注
1、DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞5-7μg 应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。
3. 1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节 Final pH 8.4 8.2 8.0 7.8 7.5 注意事项：
1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。 2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。 常见问题分析：
得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底 B．最终得到的DNA沉淀没有完全溶解
A260/A280<1.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中 B．酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。 DNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃ C．样品匀浆时使用了高速匀浆仪
RNA污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净
B．DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底
0.1M HEPES(μl) 86 93 101 117 159 Final pH 7.2 7.0 1M HEPES(μl) 23 32
3rd step 蛋白质的提取
一、材料
RNA提取步骤2中的有机相及中间层
二、设备
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂耗材
1、异丙醇：取干净50 mL摇菌管，分装40mL异丙醇。（并标注trizol PR用异丙醇和日期） 2、含0.3M盐酸胍的95%乙醇：将40 mL×盐酸胍分子量×0.3M÷1000= g溶于30mL 95%乙醇，并定容至40 mL。
3、无水乙醇：取干净50 mL摇菌管，分装40mL无水乙醇。（并标注trizol PR用无水乙醇和日期）
4、 1%SDS：取0.4g SDS溶于40mL去离子水。 5、透析袋。
四、操作步骤
1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000×g离心10分钟弃上清。
2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g离心10分钟除去。SDS-PAGE检测。
4、分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
五、注意事项：
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2．用0.1% SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。 常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分