发布时间 : 星期五 文章E.Z.N.A. Endo-free Plasmid Mini Kit 中文操作说明更新完毕开始阅读4642d68f84254b35eefd34af
1. 在10-20mL管内注入5mL LB/ampicillin(50ug/mL)培养基，接种带有目的质粒的大
肠杆菌，37℃振荡培养12-16h
2. 取1.5-5mL菌液于合适的离心管中， 10000×g室温离心1min，收集菌体沉淀 3. 小心除去上清，加250uL SolutionⅠ /RNase A，涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌
体，这一步对提高质粒产量至关重要
4. 加250uL的 SolutionⅡ，轻轻来回颠倒混匀4-6次，得到澄清的裂解液。在室温孵
育2min是必要的，但不要用力摇晃否则降低质粒纯度
5. 加125uL的预冷Buffer N3（提前置于冰上），颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉
淀，≥12000×g室温离心10分钟（4℃更好）
6. 小心移上清至干净的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution。颠倒混匀
7-10次，在冰上孵育10min，孵育过程中可颠倒几次。注：加入ETR Solution后，溶菌产物会变浑浊，但是冰上孵育后变澄清
7. 42℃孵育5min，溶菌产物再次变浑浊，12000×g 25℃离心3min。ETR Solution
会在管底呈现蓝色分层
8. 转移上清至新的1.5mL离心管中，加入0.5倍体积96%-100%的乙醇(室温)，颠
倒混匀6-7次，室温孵育1-2min
9. 取第8步混合液700uL加入到一个干净的HiBindTM DNA Mini 柱装配与2mL的收集
管内（试剂盒提供），10000×g 室温离心1min过柱 10. 弃滤液，将第8步剩余混合液离心过柱如上
11. 取500uL Buffer HB洗柱，离心过柱如上。注：这步是为了去除残留的蛋白质，并
得到高质量的质粒
12. 弃滤液，加700uL DNA Wash Buffer洗柱，离心过柱如上，弃滤液。注：浓缩的
DNA Wash Buffer使用前需按照标签提示用无水乙醇稀释 13. 重复第12步，再加入700uL DNA Wash Buffer
14. 弃滤液，将空柱子套回离心管，以最大转速（≥13000×g）离心2min，干燥柱子。
注：这一步是为了除去残留的乙醇
15. 将柱子套在一个新的1.5mL离心管中，取30-50uL Endotoxin-Free Elution
Buffer(或者水)直接打在柱子上，以最大转速（≥13000×g）离心1min洗脱质粒。注：一次可洗脱约70%-85%的质粒，可再洗一次，但会降低质粒浓度。