发布时间 : 星期五 文章第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文更新完毕开始阅读48d2004cb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb8
3．选定波长
4．打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空白管调
T=0
5．盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空白管调
T=100%(若调不到，则可调节灵敏度开关)
6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0，否
则调节“消光零”旋钮调至0。
7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值A。 8．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关。
二、电泳技术
电 泳 Electrophoresis
一、定义
电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。 电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。
二、电泳分析技术发展概况
1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：
即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。
由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。
三、电泳分析技术的分类 1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2.根据电泳电压的高低
常压电泳 0～500 V 高压电泳 500～3000V 3.根据电泳中是否使用支持物
自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳—使用支持物
(1) 按支持物的物理性状不同，可分为
①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 ②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 ④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 (2)按支持物的装置形式不同，可分为 ① 平板式电泳 ② 垂直板式电泳 ③ 垂直柱式电泳
4.根据电泳系统pH是否连续
? 连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳
? 不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如 PAGE、IFE
优点是在不同 pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。 电泳技术的特点:
? 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析; ? 样品用量极少; ? 设备简单;
? 可在常温进行; ? 操作简便省时; ? 分辨率高. 电泳技术应用
? 基础理论研究; ? 临床诊断; ? 工业制造.
双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能. 四、电泳的基本原理
? 一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。
? 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。 在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。
这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即： F’=6πrηυ
式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F’，
∴ q?E = 6πrηυ
由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。 迁移率（Mobility)——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q
M=-----------= ----------- E 6?r?
五、影响电泳速度的因素 1.电场强度（E）
E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性
E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模糊不清→分辨率下降
电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为： W=I2.R.t
上式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。
电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：
①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。 2.离子强度（I）
溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。
I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢
缓冲液的浓度可用摩尔或离子强度表示.离子强度低,电泳速度快,分离区带不易清晰,如果过低,缓冲液的缓冲量小,难以维持pH值的恒定;离子强度高,电泳速度慢,但区带分离清晰,如果过高,除了使得电泳速度过慢,还会因为离子强度增加使电泳时的电流变大,增加热量的产生,引起温度改变,对电泳不利。一般0.02~0.2M之间。 3.缓冲液的pH
pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。
缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
4.电渗（electro-osmosis）——指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。
由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃
表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。 5.分子筛
在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。 5.温度
电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）
产热可促使支持介质上溶剂的蒸发，而影响缓冲溶液的离子强度。温度升高时，介质黏度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4%。若温度过高可导致分离样品变性而使电泳失败。
醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳
Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME 一、醋酸纤维素
是纤维素醋酸酯，由纤维素的羟基进行乙酰化后制得，将它溶于有机溶剂涂抹成均匀的薄膜，待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。 厚度：0.15mm 二、特点 1.吸附作用小 2.电渗作用小 3. 需加样量少 4. 吸水性差
三、影响醋纤电泳结果的因素 1. 电泳图谱不齐 ① 点样时血清点加不均匀 ② 薄膜局部干燥
③ 电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④ 缓冲液变质
⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 2. 电泳图谱分离不清 ① 标本加量过多 ② 电流过低
③ 薄膜结构过分致密，透水性差 ④ 薄膜表面干燥 3. 电泳速度慢 ①电流过低