发布时间 : 星期四 文章第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文更新完毕开始阅读48d2004cb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb8
②供给薄膜的液量不足 ③电泳时温度过低 ④缓冲液离子强度过高 ⑤薄膜中杂质多
4. 白蛋白区带中间部分不着色，染色不足 可能为染料使用过久或加血清过多 5.γ球蛋白向反方向移动 主要因为电渗现象
可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳（实验）
[原理] CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。
将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等点电不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。
电泳后,CAM经染色和漂洗，可清晰呈现5条区带。再经脱色，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。 [器材和试剂] 1.器材
（1）醋酸纤维薄膜（8×2mm） （2）点样器
（3） 染色皿，漂洗器，镊子 （4） 722型分光光度计
（5）电泳仪：直流电源整流器，水平电泳槽 2.试剂
（1）巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.06） （2）氨基黑10B染色液
（3）漂洗液：95%乙醇、冰醋酸、H2O （4）洗脱液：0.4mol/L NaOH [操作]
1.将电泳槽置于水平平台上。将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上。
2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润。
3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。
4．用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。 5．电泳
（1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布
一端垂入缓冲液中。薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。
（2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。开启电源通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。 6.染色
电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5~10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。 7．漂洗
从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。此时清晰可见5条色带，待干。 8.定量
（1）洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4mol/l NaOH 4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。 （2）计算 吸光度总和（T）
=A+α1+α2+β+γ（吸光度） 血清蛋白组分的相对百分数： A%=A/T×100%
α1%=α1/T×100% α2%=α2/T×100% β%=β/T×100% γ%=γ/T×100% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 Agarose Gel Electrophoresis 概 述
凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。 特点：
1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定 琼脂糖凝胶的特点 （一）优点
1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗
2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。
3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性 （二）缺点
1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。
3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 应 用
1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标 脂 蛋 白
血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白
ApoC ApoD ApoE
甘油三酯 （TG） 脂类 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 （CE） 少量糖 （二）分类 1. 按电泳法分
乳糜微粒（chylomicron,CM） ?-脂蛋白 （?-位） 前?-脂蛋白（?2-位）） ?-脂蛋白 （?1-位） 2. 按超速离心法分
乳糜微粒(chylomicron,CM) ( < 0.96 ) 极低密度脂蛋白 (0.96?1.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.006?1.019) (intermediate density lipoprotein, IDL)
低密度脂蛋白LDL(1.019?1.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.063?1.21) (high density lipoprotein, HDL)
? 原理：pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。
血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳（实验）
[原理] 血清脂蛋白经饱和乙酰苏丹黑B染色后，以琼脂糖凝胶为载体，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳分离，
各种脂蛋白将分成不同区带。 [器材] 1.玻片 2.水平式电泳仪 [试剂]
1.0.5%琼脂糖（Agarose）溶液：称取0.5g琼脂糖，加巴比妥缓冲液100ml，盛于三角烧杯中，置沸水浴中煮沸溶备用。
2.新鲜血清（无溶血）
3.pH8.6、I=0.075 巴比妥缓冲液:称取15.4g巴比妥钠，2.76g巴比妥，0.292gEDTA，以水溶解后加至100ml，调至8.6，4℃保存。
4.苏丹黑B染色液：苏丹黑B 100mg，异丙醇10ml，混合。置37℃水浴使之充分溶解后，离心取上清液置室温用。 [操作] 1. 制板
配制0.5%的琼脂糖或预先配好置4℃冰箱，用时置沸水溶解，再冷却到50℃～60℃，取约4ml琼脂糖迅速铺在玻璃片上，然后放上开槽器（注意：①开槽放在中央，距一侧1.5cm处；②避免产生气泡），静置室温待凝固，把开槽器小心取下，样品槽即制成。 2. 加样
取预染血清20?l加入样品槽 （预染血清：血清0.2ml + 苏丹黑B染色液0.02ml） 3. 电泳
将载有琼脂糖凝胶玻片（已加血清样品）放在电泳槽中，槽内倒入巴比妥缓冲液，用四层纱布搭板，加样端接负极，电压120V，待最前端区带泳动至玻片2/3处时可终止电泳，观察实验结果。 [参考值]
正常人血清脂蛋白可分出三条区带： ?脂蛋白（占55%，着色最深） 前?脂蛋白（占15%，着色最浅） ?脂蛋白（占30～40%，着色居中） 在原点处应无乳糜微粒可见