发布时间 : 星期四 文章第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文更新完毕开始阅读48d2004cb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb8
60年代中期问世的一种利用pH梯度的介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。 IEFE对象只限于蛋白质和两性分子。 二、特点 （一）优点 1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位），灵敏度高（最低检出量达0.1ng），特别适用于分子量相同而电荷不同的两性大分子的分离。 2.电泳区带相当狭窄 3.重复性好 （二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质 三、基本原理 在IEFE中，具有pH梯度的介质在通以直流电时，从阳极到阴极pH值逐渐增大。蛋白质分子具有两性解离及等点电的特性。这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点失去电荷而停止移动，此处介质pH恰好等于聚焦蛋白质的pI。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到在它们的pI上聚焦为止。 可见此种方法中，pI是蛋白质组分的特性量度，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场中经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自pI相应的位置上，形成分离的蛋白质区带。 进行IEFE必须具备3个条件： ①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 ②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 ③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带 （一）pH梯度的建立——是用多种两性电解质混合物来建立的 1.一个理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备以下特点： ①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多 ⑥可溶性好 ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定 2.载体两性电解质的合成 R1和R2为H或带有氨基的烷基 合成产物是众多异构体和同系物的混合物，具有很多既不相同又相互连接的pI值。 3.pH梯度的形成 天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入pI彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度。 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e- 负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH- 因此在负极会引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a） 由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。(图b) 当环境pI95% 2-3% <2% pI 6.93 7.38 6.98 <6.87 1. PAGE与IEFE有何区别？ 2. 本实验的关键步骤是什么？ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE 一、什么是SDS？ 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。 SDS的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 一、SDS-PAGE的基本原理 （一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。 1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 ? SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚或组成它们的多肽键 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异。 蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。 （3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。 （二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。 电泳缓冲液的种类： 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。 4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品。 5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量 （三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度. （四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。 蛋白带迁移距离 Rf= ———————— 溴酚蓝迁移距离 蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= ————————— X ————————— 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离 2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图 3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量 二、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate 三、方法 1、分类 根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳 2、操作 （1） 制备分离胶