发布时间 : 星期三 文章第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文更新完毕开始阅读48d2004cb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb8
（2） 制备积层胶(堆积胶） （3） 加样品 样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形 ①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。 ②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护SH基团，而得到窄的电泳带。 ③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。 （4） 电泳 （5） 固定 （6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。 ②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。 银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。 （7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定 3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。 （2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。 （3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。 （4）“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。 （5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起 （6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（实验） [原理] 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时， 样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 [试剂] 1、30%凝胶贮备液：称取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），加蒸馏水至100ml，滤纸过滤贮存。 2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺（AP） 4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED） 5、5×电泳缓冲液：于900ml蒸馏水中分别加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS，混匀后加蒸馏水至1 000ml。 6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 7、电泳加样缓冲液 10mM pH6.8 Tris 200mM DTT 4% SDS 0.2% 溴酚兰 20% 甘油 8.正丁醇 [器材] 1、移液器 2、移液管 3、烧杯 4、垂直电泳槽 5、电泳仪 [操作步骤] 1.配制分离胶浓度8%、体积15ml H2O 6.9ml 30%凝胶贮备液 4.0ml 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml 10%SDS 0.15ml 10%过硫酸胺 0.15ml TEMED 0.01ml 2.一旦加入TEMED，混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 3.聚合完成之后，倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。 4.配制5%成层胶5ml，插入梳子，小心避免混入气泡，垂直放置室温下。 H2O 3.4ml 30%凝胶贮备液 0.83ml 1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸胺 0.05ml TEMED 0.01ml 5.在成层胶聚合时，将样品与加样缓冲液混匀，100℃加热3min。 6.成层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。 7.加样 8.电泳：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。 9.取下凝胶，固定、染色或进行Western blot分析。 离心技术
离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。这项技术在临床生物化学中常用来分离化学反应后的沉淀物，和收集生物大分子物质。
（一）离心技术的分类
根据离心原理和工作的需要，目前已设计出许多离心方法，综合起来大致可分三类：①平衡离心法：根据粒子大小、形状不同进行分离，包括差速离心法（differential velocity centrifugation）和速率区带离心法（rate zonal centrifugation）；②等密度离心法（isodensity centrifugation）：又称等比重离心法，依粒子密度差进行分离；③经典式沉降平衡离心法：用于生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化等。
依据离心机转头的旋转速度，可将离心机分为低速离心（4000r/min以内），高速离心（20000r/min，最大相对离心率可达45000g）和超速离心（30000r/min以上，最大相对离心力达645000g）三种类型。
按照离心技术的实际应用，可将离子技术分为普通离心、专用离心、制备性离心和分析性离心四大类。 （二）各类型离心机的特点和应用
1．低速离心机 根据处理样品的容量大小，可分为：锥型台式、水平型桶式、大容量立式三种。前者主要用于实验室样品的初级分离，在日常检测中的应用最广。后两种主要用于大量生物制备和血站分离血浆等。
2．高速离心机 由于运转速度快，一般适用于各种生物细胞、病毒、血浆蛋白质等分离。也可应用于有机物、无机物溶液，悬液及胶体溶液中有形成份的浓缩、提取、制备等工作，是细胞生物学和分子生物学研究的重要工具。
3．超速离心机 可分为制备和分析两种类型。
（1）制备型超速离心机：最高转速可达55000～90000r/min，可配密度梯度收集仪，密度梯度泵，各种加样、取样器等附件，整机自动化程度高，功能齐全。是医学检验、生物化学学和分子生物学领域的重要工具，可用于细胞器、病毒的分离和浓缩。
（2）分析型超速离心机：大多装有特殊设计的转头和控制系统，可直接观察了解分析样品的沉降情况。利用
特殊配备的数据处理系统，可自动计算出分离物质的沉降系数和分子量。它主要用于测定生物大分子的分子量和沉降系数，估价样品的纯度等。
四、层析技术 层 析 原 理
一． 简介
1906年，俄国植物学家茨维特(M.S.Tswett)研究植物叶子色素成分,用竖直的玻璃管,管内充填碳酸钙,然后将植物叶的石油醚浸取液由柱顶端加入,并继续用纯石油醚淋洗。因植物叶不同色素在柱内得到分离而形成不同颜色的谱带,茨维特称这种分离方法为“色谱法” （chromatography）。
二十五年后，德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。
另外他还发现了八种新的类胡萝卜素，并把它们制成纯品，进行了结构分析。
同年，他又把注意力集中在维生素的研究上。在确定了维生素A 的结构以后，于1933年从35000升脱脂牛奶中分离出一克核黄素（即维生素B2），制得结晶，并测定了它的结构。
此外，他还用色谱法从蛋黄中分离出了叶黄素；还曾把腌鱼腐败细菌中所含的红色类胡萝卜素确定离析出来并制成结晶。Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖.
随着色谱技术的发展，色谱对象已不再限于有色物质，但色谱这一名词却沿用下来。现亦称作色层法或层析法。色谱法最初仅仅是作为一种分离手段，直到五十年代，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，成为一种独特的分析方法。是几十年来分析化学中最富活力的领域之一，也是生命科学和制备化学中广泛应用的一种手段
层析原理：
在一般情况下,不同物质在不同的两相,即固定相和流动相中具有不同的分配系数,当这些物质随着流动相移动时,它们在两相中反复多次分配从而使各物质得到完全的分离。
分配系数：分配系数：通常被用来叙述一种化合物在互不相溶的两个相中分配的状况。对于层析来说，分配系数定为移动相中的深度除以固定相中的浓度。
有效分配系数：定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘以两个相的体积比。
理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。
二． 分类
色谱法有多种类型，也有多种分类方法。 （一）按两相所处的状态分类
层析法中，将上述最早起分离作用的柱称为层析柱，固定在柱内的填充物（如碳酸钙）称为固定相，沿固定相流动的流体（如石油醚）称为流动相。
以液体作为流动相，称为“液相色谱”（liquid chromatography）；用于在溶液里分离包括金属离子和有机化合物的分析物.其流动相为溶剂,固定相为固体、离子交换树脂或吸附于担体（惰性固体物质）表面的流体。 高效液相色谱(HPLC) 。 一种利用高压泵以增加分离效率的液相色谱.
用气体作为流动相，称为“气相色谱”（gas chromatography）。用于沸点较低(<400℃)、具有较高热稳定性、分子量较小(<400)的有机物的分离。流动相是气体,而固定相通常是附着于担体上的固定液或固体吸附剂。
固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和载附在担体上的液体(固定液)作为固定相。 层析法按两相所处的状态又可以分为：
液－固色谱（liquid-solid chromatography） 液－液色谱（liquid-liquid chromatography）