发布时间 : 星期二 文章第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文更新完毕开始阅读48d2004cb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb8
二维薄层色谱是二次利用薄层色谱的方法分离仅由一种溶剂未能分开的样品斑点.在一个样品在一种溶剂中跑板之后,TLC层析板被移走,干燥,旋转90o,再于另一种溶剂中跑板.每一个在第一次跑板中包含混合物的斑点即可被分离,最后的色谱图是样品斑点的二维矩阵。
4·特殊薄层：针对某些性质特殊的化合物的分离与检出，有时需采用一些特殊薄层。
① 荧光薄层：有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光，又无适当的显色剂时，则可在吸附剂中加入荧光物质制成荧光薄层进行层析。展层后置于紫外光下照射，薄层板本身显荧光，而样品斑点处不显荧光，即可检出样品的层析位置。常用的荧光物质多为无机物。其一是在 254nm紫外光激发下显出荧光的，如锰激洁的硅酸锌。另一种为在365nm紫外光激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌硫化镐。
② 络合薄层：常用的有硝酸银薄层，用来分离碳原子数相等而其中C一C双键数目不等的一系列化合物，如不饱和醇、酸等。其主要机理是由于C一C键能与硝酸银形成络合物，而饱和的C一C键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上，化台物可由于饱和程度不同而获得分离。层析时饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一个双键的较含两个双键的Rf值高，含一个三键的较含一个双键的Rf值高。此外，在一个双键化台物中，顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行。因此，还可用来分离顺反异构体。 移动速率( Rf ):
溶质移动距离 溶剂前沿移动距离
③ 酸碱薄层和PH缓冲薄层：为了改变吸附剂原来的酸碱性，可在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制薄层。例如硅胶带微酸性，有时对碱性物质如生物碱的分离不好，如不能展层或拖尾，则可在铺薄层时，用稀碱溶液0.1～0．5NNa0H溶液制成碱性硅胶薄层。例如猪屎豆碱在以硅胶为吸附剂时，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）为展开剂Rf＜0．1，采用碱性硅胶薄层用上述相同展开剂，Rf值增至0．4左右。说明猪屎豆碱为--碱性生物碱。
亲 和 层 析
（一） 原理
亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术。首先寻找能被该分子识别和可逆结合的生物专一性物质，称为配基。其次把配基共价结合到层析介质（或称载体），使配基固定化，最后把固定化配基填充在层析柱内，制成亲和层析柱。
亲和层析的步骤与一般层析过程基本相同。 常见具有专一性亲和力的生物分子对：
酶――底物（包括竞争性抑制剂和辅酶因子） 抗原――抗体 激素或药物――受体 蛋白质――运载蛋白质 DNA――DNA或RNA
（二） 特点
1、 只需一步纯化步骤 2、 产物非常纯
3、 可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、 还可去除已变性或部分降解物质
（三） 载体的选择
载体要求：（1）多孔立体网状结构
（2）惰性，非特异吸附要低 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）有良好的液体流动性
1、 载体的排斥效应 小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合
2、 载体的空间障碍 载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。 3、 常用载体
（1） 纤维素 优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外
缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一
非专一吸附强 易受氧化生成醛基
（2） 葡聚糖凝胶：经环氧氯丙烷交联，立体网格多糖类，物化性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。 （3） 琼脂糖凝胶：D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的链状多糖，用于亲和层析为交联珠状凝胶。
浓度 商品
2％ Sepharose 2B Ultrogel 2B 4% Sepharose 4B Ultrogel 4B 6% Sepharose 6B Ultrogel 6B
能迅速活化接上各种功能基因，孔径大，流速快，非特异吸附少，稳定性好（特别是Sepharose CL）
（4） 聚丙稀酰胺
由丙烯酰胺与N’,N’-甲叉双丙烯酰胺交联而成
理化性能稳定，有较多酰胺基可代配基连接，适合于亲和力较低的系统。孔径较小，pH过高或过低时酰胺基易水解。 （5） 其他载体
Ultrogels AcA 由聚丙烯酰胺和琼脂糖混合组成，既有羟基又有酰胺基，不能接触强碱、高温。 磁性胶Cmagnogels AcA 44 在以上混合胶中加入7％四氧化三铁，当悬浮液中含有不均匀粒子时，可依靠
磁性将载体与粒子分离。
Trisacryls GF 新的丙烯类单体（N-丙烯酰-2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇）与双功能单体聚合。
不与有机溶剂作用，不受变性剂、洗涤剂等影响。
在酸性溶液稳定，但不能与碱接触，能在-20℃保持或120℃消毒。
Spheron或Separon 是甲基丙烯酸羟乙酯与甲基丙烯酸乙二酯的非均相共聚物。可在孔径大小、孔径分布、
比表面积，活性羟基的多少等方面变化，在有机溶剂和pH变化条件下，其体积不会变化，20％盐酸中150℃加热24小时，载体不发生变化。但甲基丙烯酸羟乙酯有较大疏水性，产生非特异吸附，可用作疏水层析的载体。
（四） 配基
1、 配基的选择
需仔细研究大分子同配基之间作用的性质 如单底物酶促反应
A P
↓ ↑ E EA EP E A与P均可用于亲和层析
有序的双底物酶促反应
A B D Q
↓ ↓ ↑ ↑ E EA EAB EPQ EQ E A适合， B不适合
如果是无序的双底物酶促反应，则A和B都可以，取决于亲和力和固定的难易程度。
2、 亲和势
是配基对互补分子亲和力大小的量值，也是制备高效亲和柱的重要参数，一般在10－4－10－8M之间。解离常数高则不易连接，但解离常数太低，又会洗脱困难，如生物素－抗生物素蛋白解离常数为1×10－15M，要用pH1.5的6M胍-HCl才能洗脱。 3、 配基浓度
对亲和势较低系统（KL≥10－4M），增加配基浓度有利于吸附。但配基浓度太高易使配基活性中心互相遮盖，吸附力下降。同时非特异吸附增加。当增加配基浓度有困难，而亲和势又较低时，可用增加亲和柱的长度来提高吸附效率。
配基浓度太高又可使洗脱困难。
推荐配基浓度为1－10微克分子配基/毫升凝胶，约2μmol/ml为最好。 配制加入量比要求偶联量大几十倍。蛋白类配基含量5－10mg/ml。 4、 配基偶联的位置
需选用合适的，不影响与大分子连接的部位。 5、 配基大小的选择
亲和柱制备首选大分子配基。 （五） 吸附和洗脱 1、影响吸附的因素
缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。 流速尽可能慢，<10ml/cm2.小时
上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml. 上样体积取决于亲和势，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。 2、常用洗脱方法 （1） 非专一性洗脱
改变洗脱液pH值、离子强度，也可进行梯度洗脱。 离子洗脱能力强弱：CL- 如吸附通过疏水作用，可用降低极性的缓冲液洗脱（乙二醇）。 （2） 特殊洗脱法 当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。 断键方法： 硫酯键： 用pH11.5（或1N）羟胺处理半小时 偶氮键： 0.1M连二亚硫酸钠的0.2M硼酸缓冲液（pH9） 二硫键：用巯基乙醇，半胱氨酸，二硫苏糖醇处理 （3） 专一洗脱方法 以酶为例： 竞争性效应――ESI不如EI稳定，可用游离配基或抑制物（I）洗下，正洗脱。 非竞争性效应――ESI与EI同样稳定，I不能用作洗脱剂。 反竞争性效应――ESI比EI稳定，可去除杂蛋白，然后减少I浓度洗脱。 双底物酶――吸附时存在另一底物，从洗脱液去除时就可洗脱，负洗脱。 4、 亲和柱的再生 已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。 再生步骤：先用起始缓冲液重复平衡一次。 接着用高离子强度和低离子强度溶液处理。 最后用弱酸或弱碱溶液处理。 （六） 配基和载体的联结 1、 琼脂糖的CNBr活化与配基的偶联。 琼脂糖在碱性条件下用溴化氢处理，可引入活泼的“亚氨基碳酸盐”，再在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶联，形成N-取代的亚氨基碳酸盐、氨基甲酸酯和异脲衍生物。氰化物中间体也能水解成无活性氨基甲酸酯。因此活化时间应控制在几分钟内。 商品溴化氢为白色结晶，熔点51.3℃，沸点61.3℃。黄色或桔色的CNBr易爆炸分解，不能使用。 2、 聚丙烯酰胺凝胶载体的活化 这类载体的酰胺基能被含氮化合物置换产生游离氨或经碱性水解制备多种衍生物，由此再与配基偶联制备亲和柱。 利用戊二醛可将蛋白质一类配基直接偶联到聚丙烯酰胺。 醛基既与酰胺基作用，又与蛋白质上游离氨基形成西夫碱。 在37℃，pH6.9进行17小时就能反应完全。 3、 偶联配基量的测定 （1） 测定反应液及洗涤液中残留的游离配基。 （2） 直接分光光度法测定 将有或无配基凝胶悬浮液直接测定。 （3） 凝胶融化后测定 60℃可融化，在70多度可测定。 （4） 酸解或酶 配基从载体上断下来，然后测定 （5） 元素测定 可测氮、磷、硫等元素