发布时间 : 星期二 文章第二章临床生物化学实验室基本技术与管理 - 3 - 图文更新完毕开始阅读48d2004cb94ae45c3b3567ec102de2bd9605deb8
（6） 酸碱滴定 （7） 巯基的测定 （七） 其他亲和层析 1、 金属鳌合亲和层析
将环氧活化Sepharose 6B与金属鳌合剂（亚氨二醋酸，氨基水杨酸，EDTA）偶联成配基，再用金属离子溶液处理（Zn++,Ca++,Co++,Ni++,Hg+）就制成金属鳌合亲和层析柱。可分离纯化芳香族化合物、烯烃及含O、N、S配位化合物。一些含组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、蛋白质、寡核苷酸、核酸等。
2、 有机染料亲和层析
有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD＋的结构，一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶对它们有一定的亲和力。因此，可用这些染料制成亲和层析柱分离酶类及白蛋白、干扰素、脂蛋白等。 3、 疏水层析
将疏水性碳氢链配基偶联到载体上，与蛋白质疏水区形成疏水链而达到分离纯化效果。
4、 亲和电泳
配基化学修饰后偶联到丙烯酰胺或将层析吸附剂包埋在琼脂糖凝胶，电泳时有亲和作用化合物迁移慢或保留在原点。优点：样品用量少，分离速度快。
离子交换层析
Sober 和 Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上， 还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。 近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。
一、基本理论
原理：离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段──吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离，但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。 举例：------阴离子交换树脂分离蛋白质的原理和方法:
将阴离子交换树脂（本身带正电荷）颗粒填充在层析管内， 当带负电荷的蛋白质(pH>pI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带 电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。然后再用含 阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来， 增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质 被分开。 （一） 离子交换作用
2K＋＋SO4――＋Ba+Cl2（固体）→ BaSO4↓＋2K+＋2Cl- K+Cl－＋Na+NO3 Na+Cl－＋K+NO3－
（二） 离子交换平衡 （三） 离子交换动力学
假若外界溶液中有B＋S－盐，树脂相中有A＋离子，则B＋离子与A＋离子的交换过程有五步：
（1） B＋离子通过扩散穿过树脂柱子周围的静心相液膜 （2） B＋离子通过树脂内部的液膜到达可交换点 （3） B＋离子与树脂上活性离子A＋进行交换 （4） A＋离子从树脂内部液膜向外扩散
（5） A＋离子扩散穿过树脂粒子周围的静心相液膜，到达外界溶液中。
上述1，2，4，5步的驱动力是浓度差，其分子扩散作用符合Fick’s扩散定律，第3步是由化学势所引起的。
二、离子交换的分类及常见种类
（一） 分类
离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小，还可分为强、弱两种 1、 强酸型阳离子交换树脂
主要以磺酸基（－SO3H）为功能基因，它的解离不受外界溶液pH影响。 典型交换方程式为：
RSO3H ＋ NaCl RSO3Na ＋ HCl
2、 弱酸型阳离子交换剂
功能基团为羧基（－COOH），酚羟基（－OH）等，它们电离程度小，交换性能和溶液的pH有关，在酸性溶液中无交换作用，羧基pH》酚羟基pH>9
如甲基丙烯酸和二乙烯苯的羧基阳离子交换树脂交换容量与pH关系：
pH 交换当量（毫克当量/克） 典型交换方程式：
RCOOH ＋ NaOH RCOONa ＋ H2O
3、 强碱性阴离子交换剂
含三甲胺的称为强碱Ⅰ型，含二甲基乙醇胺称为强碱Ⅱ型
Ⅰ型碱性强，用途广，但再生困难 Ⅱ型热稳定性差，< 60℃使用 pH条件都不受限制 典型交换方程：
RN（CH3）3Cl ＋ NaOH RN（CH3）3OH ＋ NaCl
4、 弱碱性阴离子交换树脂
以伯胺基（－NH2）、仲胺基（＝NH）以及叔胺基（≡N）或吡啶基为功能基团，交换能力随溶液的pH条件而变化，pH越低交换能力越强。
典型交换方程式：
5 6 7 8 9 0.8 2.5 8.0 9.0 9.0
RNH3OH ＋ HCl RNH3Cl ＋ H2O
生成的盐RNH3Cl容易水解呈酸性，故水冲洗不到中性。
5、 大孔型离子交换树脂
在苯乙烯-二乙烯苯中加入一种惰性溶剂（致孔），以应后再去掉这种溶剂，则树脂中形成“大孔”。
大孔型离子交换树脂体积变化小，微孔不会封闭，比表面积大，如1g普通强酸树脂比表面积为0.1米2，大孔型
可到100米2以上。
（二）种类
1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素）， 阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维素（DEAE-纤维素）。
2.交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 阳离子交换剂有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。
3.琼脂糖离子交换剂：是将DEAE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B 上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大， 性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。
三、实验操作
（一）交换剂的处理，再生与转型
新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有一些杂质，所以要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：新出厂干树脂用水浸泡2 小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N NaOH搅抖4小时，除硷液， 水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳离子树脂带Na+，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。阴离子树脂转型也同样，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再生都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。 （二）柱上操作
⑴交换剂装柱，最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。 ⑵上样向层析柱内倾入样品液 ⑶洗脱与收集
不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。
四、应用离子交换技术注意事项： 1、 等电点和解离常数
不同等电点的二性化合物需不同类型的离子交换剂
阴离子交换树脂类型 氨基酸PI 吸附性能 弱碱性阴离子交换树脂 (Amberlite IR-4B) 强碱性阴离子交换树脂 (Amberlite IRA-400)
2、 溶液的pH值
上柱溶液pH值影响分离样品及交换树脂的解离程度，也影响离子交换吸附作用的强弱。因此选择合适的pH洗脱条件有利于提高分离效率。 3、 树脂的充填
<4 容易 >8 困难 <10 容易 >10 困难
对分离效果有很大影响，充填好的树脂层应无空隙和气泡。
粒子粗的要求均匀，难于分离样品可用较细粒子，如100－200目或200－400目。粒子越细，装柱后压力降大，流速慢，但分辨率高，容易达到平衡，树脂用量少，小目数树脂适合于制备，大目数树脂适合于分析。
4、 柱的高度和容量
柱高一些有利于分离交换势低而难于分离的样品。 但过高会影响流速，延长分离时间。
交换柱直径大小可改变柱的容量，但也与流速和分离时间有关。
五．离子交换层析的应用
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
组织DNA的提取和纯化
[实验目的]
学习从生物组织中提取DNA，为研究DNA的理化性质与结构功能打好基础。 [原理]
粉碎组织DNP
裂解细胞膜、核膜 裂解液 DNP 苯酚、氯仿
DNA（RNA） RNA酶 Protase Ｋ 苯酚、乙醇
纯DNA 紫外定量
[方法]
每克组织 + 2ml裂解液 组织捣碎器，匀浆
取3ml匀浆，加等体积苯酚-氯仿，摇匀5min，2,500rpm 10min 取水相，重复抽提一次
加等体积氯仿-异戊醇,摇匀5min, 2,500rpm 10min 取水相
加5M NaCl至终浓度0.3M NaCl, 2.5体积冰无水乙醇 摇匀 见白色沉淀,玻棒挑起 DNA
70%乙醇洗涤二次 沉淀溶于2ml TE
紫外分光光度计测A260nm,A280nm
[鉴定]
低浓度琼脂糖电泳来检查DNA分子完整性，电泳迁移后不应有扩散或拖尾现象。