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2.4.5 单因素测量——料水比
1）在5个100ml小烧杯中称取样品各1.0g，然后按照1：20、1：30、1：40、1：50、1：60的料水比，分别加入20、30、40、50、60ml去离子水。 2）放于90℃水浴中加热90分钟。每隔10min搅拌一次。 3）取出后分别抽滤，取滤液（约为40ml）,加热浓缩至约10ml。
4）常温下冷却，在每个烧杯中各加入40ml无水乙醇并搅拌使其混合均匀，静置，放于4℃冰箱中，过夜。
5）次日取出抽滤，将滤饼连同滤纸一起放于75℃烘箱中烘干2h后，取出称量，记录质量。对比并取最大质量的温度。 2.5响应面分析实验
有以上的单因素实验，初设定各温度、提取时间、料水比的大体区间，按下表进行多因素优化实验取17个烧杯，样品取0.8g，其余按表2.1进行添加，因素水平的具体数值见表2.2。
表2.1
Run 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
X1（温度）
-1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
水平 X1（时间）
-1 -1 1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0
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X1（料水比）
0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0
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表2.2
因素 温度（℃） 提取时间（min） 料水比（mL/g）
编号 X1
X2 X3
-1 80 60 40
水平 0 90 90 50
1 100 120 60
实验方法同单因素测定，抽滤烘干后依次称重。
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3.单糖分析
3.1 材料与仪器
单糖标准品（Man、GlcN、Rha、GlcUA、GalUA、GalN、Glc、Gal、Xyl、Fuc、核糖），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美国sigma公司；三氟乙酸（TFA）、氯仿，氢氧化钠，盐酸等均为国产分析纯。
Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；
KP-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，中冉科技发展有限公司。 3.2实验方法 3.2.1 样品的全水解
准确量取50 μL样品，分别加入0.45 mL水稀释，再分别加入0.5 mL 4.0 mol/L 三氟乙酸(TFA)（终浓度2.0 mol/L），封管后于110 ℃水解6 h，反复加甲醇氮吹干除去TFA，最后用0.5 mL蒸馏水溶出。 3.2.2 单糖标准品溶液的配制
等摩尔十糖标准品的制备：精确称取110℃干燥至恒重的10种单糖标准品(Glc, GlcN, GlcUA, Gal, GalN, GalUA, Man, Rha, Fuc, Xyl)各5 mg，用0.5 mL蒸馏水溶解，按照各个单糖的相对分子质量之比吸取相应的量并将其混合，可得到等摩尔的10单糖标准品混合液，每0.1 mL分装于1.5 mL离心管中于-20 ℃冷藏，可现配现用。
准确称取核糖标准品5 mg，溶于1 mL水中，分装于1.5 mL离心管中（每管100 μL），于-50 ℃冷冻保存。
准确称取阿拉伯糖标准品5 mg，加水溶解，终浓度为2.5mg/ml。分装于1.5 mL离心管中（每管100 μL），于-50 ℃冷冻保存。 3.2.3 样品和标准品的PMP衍生
准确吸取样品以及标准品0.1 mL，分别加入0.1 mL的0.3 mol/L氢氧化钠溶液和0.12 mL的0.5 mol/L PMP衍生试剂（PMP溶于甲醇中），于70 ℃水浴避光衍生1 h，室温下用0.1 mL的0.3 mol/L盐酸溶液振荡中和以终止反应。用氯仿
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离心萃取PMP试剂，反复萃取约4次可将多余的PMP除尽，最后将上清液通过0.22 μm微孔滤膜后，用高效液相色谱法分析。 3.2.4 HPLC分析
色谱柱：KP-C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm） 流动相：PBS（pH6.7）：乙腈=83：17（V/V） 流速：0.8mL/min 柱温：30 ℃ 进样量：20 μL
检测器：紫外检测器（245nm）
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