发布时间 : 星期一 文章渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白更新完毕开始阅读5568076eb94ae45c3b3567ec102de2bd9605ded0
渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白
许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质，这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎，使目标产物释放出来，然后进行分离纯化。破碎细胞主要采用的方法有机械法和非机械法两大类。机械破碎处理量大，破碎速度较快，时间短，效率较高，是工业规模细胞破碎的重要手段，细胞受到挤压，剪切和撞击作用，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施，机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。其中，超声波法是一种很强烈的破碎方法，细胞破碎是利用声频高于15－20KHz的超声波在高强度声能输入下进行的，普遍认为其破碎机理是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击力压力，由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体 产生流动而使细胞破碎。机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产，但它仍有许多不足之处，如大量细胞碎片的产生，胞内所有可溶性杂质蛋白的释放，发酵液粘度增加等。这给后处理工艺带来了很大难度，而非机械破碎方法，其条件比较温和，有利于存在细胞膜附近目标产物的高活力释放回收，适用于所有微生物细胞的破碎，包括物理法、化学法和酶溶法。细胞物理破碎方法比如渗透压冲击法（Osmotic Shock）。渗透压冲击法是各种细胞破碎方法中最为温和的一种。将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大。
大肠杆菌是大多科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。周质空间是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构，能提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境。在大肠杆菌周质空间表达的重组蛋白有众多优点，由于周质空间的蛋白含量低，蛋白酶活性要比胞质中低，所表达的目的蛋白能避免胞内降解而稳定的存在，有利于目的蛋白的浓缩。但是周质蛋白提取需要定向释放技术，该技术的关键在于只破坏大肠杆菌的
外膜而不损害内膜，否则大肠杆菌胞内蛋白的和核酸的释放将给目的蛋白的纯化带来困难。。
利用渗透压冲击法，研究者们已经成功地从大肠杆菌中分离纯化出许多具有重要价值的目标蛋白，比如血管内皮生长因子受体-2。血管内皮生长因子受体-2具有重要的治疗意义。Wanlu Cao等采用并优化了渗透压冲击法有效的提取和浓缩这种受体[1]。文中，通过5000g离心30min收集发酵罐中的菌体，去上清，重悬菌体，并混匀，加入等量的渗透压冲击缓冲液（36%蔗糖，20mM磷酸缓冲液，pH7；2.5Mm EDTA），在20℃下充分混匀10分钟，迅速加入5倍体积得得预冷蒸馏水，引发渗透压冲击，经过20分钟的平衡时间，悬浮液在4℃下离心（7500g，20min），收集上清即为大肠杆菌周质破碎上清，用于进一步纯化。渗透压冲击法分离蛋白的优化方法曾经被多次仔细的研究过，比如在Rathore AS等的《大肠杆菌表达蛋白分离的渗透压冲击法的优化》一文中，平衡时间，渗透缓冲液的浓度和类型，pH值对于该法具有关键作用。研究表明在渗透冲击之间增加平衡时间和渗透缓冲液中的Tris-HCl的浓度，初始细胞在渗透缓冲液中的扩散能够提高提取的效果[2]。
在利用大肠杆菌制备C-藻青蛋白时，Ramos, Amparo等改进了一种大规模纯化该蛋白的方法，藻青蛋白的提取通过渗透压冲击法并通过层析法分离离心后的上清液。在提取的过程中，溶剂中添加了0.01%的叠氮化钠，2g菌体与40ml的缓冲液混匀，并利用磁力搅拌器将液体和细菌充分混匀，时间大约30min。结束后，将液体转移到离心管中，在12000rpm下离心15min，收集上清[3]。
渗透压冲击法还被用于分离大肠杆菌合成的人抗体片段。在该研究中，作者利用自我切割亲和标签技术来对几种目标蛋白进行分离，其中两种蛋白含有二硫键。这些蛋白首先通过基因工程的方法与自我切割几丁质结合结构域（内含肽标签），并通过几丁质琼脂糖树脂进行纯化。通过将目的基因与内含肽的片段融合后，表达的蛋白能够被大肠杆菌分泌到周质空间，通过渗透压冲击法能够被释放出来[4]。
应用渗透压冲击法裂解细菌时，所表达的蛋白不能够形成包涵体，应该在目标蛋白上连接一段信号肽，使表达的蛋白能够分泌到周质空间，否则时间效果将不如其他裂菌方法比如超声波法。蔡媛媛等在构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体胞外功能区的原
核表达质粒，优化诱导蛋白表达的相关条件，检测切胶纯化所得蛋白的抗原结合活性，以及亲和层析纯化蛋白的促凋亡功能的研究中同时比较超声、渗透冲击和 IP 裂解三种破碎细菌方法，在A600值、IPTG以及诱导时间都相同的情况下，37℃出现包涵体表达，裂解细菌方法的比较中，渗透冲击法以及 IP 裂解法的实际效率不及超声法，实验者可根据实验目的来选择最适合的方法，需注意的是，若要提取上清里的可溶性蛋白，超声时菌液一定要冰浴以防蛋白高温变性[5]。 参考文献： 1.
Cao, W., et al., Periplasmic expression optimization of VEGFR2 D3 adopting response
surface methodology: Antiangiogenic activity study. Protein Expression and Purification, 2013. 90(2): p. 55-66.
Rathore, A.S., R.E. Bilbrey, and D.E. Steinmeyer, Optimization of an osmotic shock procedure for isolation of a protein product expressed in E. coli. Biotechnol Prog, 2003. 19(5): p. 1541-6.
Zhang, C., et al., Changed loading conditions and lysate composition improve the purity of tagged recombinant proteins with tacn-based IMAC adsorbents. Biotechnol J, 2015. 10(3): p. 480-9.
Ramos, A., et al., Development of a process for large-scale purification of C-phycocyanin from Synechocystis aquatilis using expanded bed adsorption chromatography. Journal of Chromatography B, 2011. 879(7–8): p. 511-519.
Wu, W.-Y., et al., Intein-mediated one-step purification of Escherichia coli secreted human antibody fragments. Protein Expression and Purification, 2011. 76(2): p. 221-228.
2.
3.
4.
5.