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2008级硕士研究生膜片钳技术试题
请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！
问答题（共100分）
1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？
答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）
离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。
膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。
2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类：
（1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode）
微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。
(2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。
(3)膜内面向外式（Inside-out）
按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。
(4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。
3、膜片钳技术的应用范围有哪些？
答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子
通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流
的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率,还可用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。结合分子克隆和定点突变技术,膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。另外,利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。
4、膜片钳实验的基本操作步骤包括哪些？
5、使用打孔全细胞膜片钳记录（perforated whole-cell patch clamp recording）的优点是什么？
答：膜片钳全细胞记录相比，打孔膜片记录技术有如下优点：
(1)由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不通透。因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使等分子仍可正常运作。 (2).因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子浓度就不受电极液的影响。因此，可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离Ca2+的水平。
(3).该技术对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记录及膜片钳全细胞记录，一次记录持续3小时并不少见。
(4).在用负压或电压脉冲打破细胞膜以形成膜片钳全细胞记录时，常使高阻密封丧失，而该技术则很少见高阻密封丧失。
(5).该技术得到的电极串联电阻较膜片钳全细胞记录的低或至少相等，并且相当的稳定。
(6).用该技术记录时的细胞膜电容更易补偿。
6、传统的全细胞膜片钳记录（conventional whole-cell patch clamp recording）过程中怎样进行质量控制？
答： 全细胞记录时，电极液应为低Ca2+,高K+溶液。高阻密封形成后，置MODE
于VC,用17 C-FAST和19 τ-FAST旋钮抵消由于电极头和电极管壁形成的瞬时电流。然后直接向电极内作短暂的脉动抽吸，或给予脉冲电压(200mV)均可使电极内的细胞膜破裂,此时电容瞬时电流明显增大。用18 C-SLOW和20 τ-SLOW旋钮将这一电流调小，即可进行全细胞记录。因电极与细胞内相通，２４VP OUT输出为跨膜电位。全细胞记录的几个注意事项:
1.电极尖端直径比较宽而且锥度陡，电阻约1-3MΩ。
2. 放大器的反馈电阻为10GΩ，因此当记录电流超过1nA时，放大器饱和，此时应使用反馈电阻小的JZ-221J探头。(3)电极内液可以迅速改变细胞内液，因此电极液应与细胞内液一致,典型的哺乳动物细胞内液为(mmol/L)：140KCl, 2 MgCl2, 11 EGTA-KOH, 1 CaCl 2, 10 HEPES，PH7.2。其中H+和Ca2+浓度最为重要。
7、建立膜片钳记录系统大致需要哪些基本设备？
答：建立膜片箝记录系统大致需要一下基本设备：(1).膜片钳放大器(2). 示波器
(3). 刺激器(4). 倒置显微器(5). 微操纵器(6) 电信号记录用录音机或数字式录像机(7). 屏蔽笼及防振工作台 (8). 微电极毛坯拉制器、微电极拉制器及微电极抛光仪(9). 电信号处理软件、计算机及其接口
8、膜片钳实验的主要影响因素是什么？