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高效液相色谱同时检测蛋白饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、
糖精钠、脱氢乙酸的前处理方法研究
李玉强，晏晓清，余慧，张艳芳，程卫东
（黄冈市产品质量监督检验所，湖北 黄冈 438000）
摘要：建立了二极管阵列─反相高效液相色谱同时快速测定蛋白饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸五种食品添加剂的检测技术。本文改进的前处理方法操作简便，试验精确度和准确度良好，非常适合应用在大量蛋白饮料样品的快速检测工作中。
关键词：高效液相色谱；蛋白饮料；安赛蜜；苯甲酸；山梨酸；糖精钠；脱氢乙酸
The simultaneous determination of acesulfame potassium, benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium and dehydroacetic acid in protein beverages by high performance liquid chromatography
and researches of the pretreatment method
Li Yu-qiang, Yan Xiao-qing, Yu Hui, Zhang Yan-fang, Cheng Wei-dong
(Huanggang Product Quality Supervision and Inspection Institution, Hubei Huanggang 438000)
Abstract The detection technology of simultaneous determination of five food additives of acesulfame potassium, benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium and dehydroacetic acid in protein beverages by high performance liquid chromatography with diode array detector was established. The improved pretreatment method with high precision and acccuracy in this dissertation, simple in operation, was singularly appropriate to use in the rapid detections of a large number of protein beverages.
Key words high performance liquid chromatography; protein beverages; acesulfame potassium; benzoic acid; sorbic acid; saccharin sodium; dehydroacetic acid
在检测安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸等指标的前处理过程中，需要对提取液进行过滤，而蛋白饮料中蛋白质含量较高，影响过滤效率，是影响上述添加剂快速检测的主要环节。在水中，苯甲酸和山梨酸溶解度较低，按照GB/T 23495采用亚铁氰化钾和醋酸锌进行蛋白质沉淀[1]后，苯甲酸和山梨酸与杂质一起沉淀，影响测定的准确性[2,3]。而按照GB/T21703调节pH值后，用亚铁氰化钾和醋酸锌沉淀蛋白质，再用甲醇定容[4]，则液相色谱图中组分峰出现拖尾现象，影响组分峰定量的准确性。因此有必要针对蛋白饮料的前处理方法进行改进，论证检验方法的实用性，使得数据准确可靠，操作更为简单，便于在基层常规检测工作中推广。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 Waters e2695 分离模块，Waters 2998 PDA 检测器，超声清洗器。
1.1.2 试剂 色谱纯甲醇，超纯水，0.5mol/L氢氧化钠，0.42mol/L 硫酸锌，0.02mol/L 乙酸铵，1.00mg/mL苯甲酸、山梨酸、糖精钠（国家标准物质中心），配制250mg/L的安赛蜜储备液和110mg/L的脱氢乙酸储备液（北京上立方联合化工技术研究院）。
1.1.3 色谱条件 色谱柱：TopsilTMC18（250mm×4.6mm×5μm）色谱柱，柱温：30℃，检测波长：230nm，流动相：甲醇:0.02mol/L的乙酸铵（8:92），流速：1.0mL/min，进样体积：20μL。
1.2 前处理方法 称取1g蛋白饮料（精确至0.001g）于50mL比色管中，加入1mL NaOH 溶液，摇匀，加入2mL有机沉淀剂，再分别加入1.5mL ZnSO4溶液、1.5mL NaOH溶液和
5mL超纯水，超声处理后用超纯水定容至刻度，混匀，静置5min。上清液过滤（双层滤纸），滤液经0.45μm滤膜过滤后上机。 2 结果与分析 2.1 样品前处理
蛋白饮料中蛋白质含量较高，在前处理过程中样品极难通过滤纸和滤膜，很大程度上影响了检测效率，因此需要采取有力措施除去蛋白质。因苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸在水中的溶解度较低，加入蛋白质沉淀剂后与杂质一起被沉淀，影响测定的准确性[2]，因此需要先将苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸转化为易溶于水的盐。另外，氢氧化钠有沉淀蛋白质的作用[5]，因此本文选择先用氢氧化钠促进苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸在水中的溶解。
由于硫酸锌和氢氧化钠对蛋白质的沉淀能力有限，考虑在不稀释样品的前提下，先加入硫酸锌和氢氧化钠并添加少量有机试剂使样液先进行蛋白质沉淀，再进行稀释和超声处理。我们选用常用的有机试剂甲醇、乙腈、丙酮、正己烷进行蛋白质沉淀试验，结果表明，经过改进的沉淀剂添加方法，能明显加强蛋白饮料中蛋白质的沉淀，当添加2mL甲醇、乙腈或丙酮时，与不加有机试剂相比，样液分层效果更佳。几种有机试剂相比，正己烷的分层效果最差。
从色谱图来看，加甲醇沉淀蛋白质，苯甲酸的峰出现拖尾现象，如图1所示。因为甲醇极性相对较大，使得检测样液极性与流动相极性差别加大，影响目标化合物在色谱柱中的分离，表现为峰拖尾现象。
苯甲酸 - 11.8640.018安赛蜜 - 9.1140.0160.0140.012AU0.0100.0080.0060.0040.0020.0009.009.5010.0010.5011.0011.5012.0012.5013.0013.5014.00分钟14.5015.0015.5016.0016.5017.0017.5018.00山梨酸 - 18.04018.50 图1 添加甲醇的样液中的混标色谱图
在同一蛋白饮料中，添加安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸的混合标样，样品定容后，这五种标准物质的浓度分别为：安赛蜜0.354mg/L、苯甲酸和糖精钠各0.200mg/L、山梨酸0.242 mg/L、脱氢乙酸0.210 mg/L。选取沉淀效果最好的丙酮和乙腈作为有机沉淀剂对样品前处理后，分别超声处理15min和30min，再进行上机测试，测试结果见表1。由表1，可知经丙酮和乙腈沉淀的样品，超声处理15min后，糖精钠和脱氢乙酸的回收率较低。考虑到前处理过程中添加剂分散不够均匀的可能，延长超声时间至30min，由测试结果可知，添加丙酮的样品中糖精钠和脱氢乙酸的回收率均有较大提升，而添加乙腈的样品中糖精钠和脱氢乙酸的回收率变化较小。因此，确定前处理过程中，以丙酮作为有机沉淀剂，超声处理时间为30min。
表1 不同前处理方法的各组分回收率 回收率（%） 检测项目 丙酮沉淀，超丙酮沉淀，超乙腈沉淀，超声乙腈沉淀，超声声15min 安赛蜜 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 脱氢乙酸 92.56 109.75 90.61 81.91 78.15 声30min 94.51 107.26 92.30 98.53 92.01 15min 92.83 107.67 91.22 84.10 74.15 30min 93.56 99.75 92.82 84.13 73.04 2.2 标准曲线的建立
通过对混合标准溶液的逐级稀释，分别进样20μL，五种食品添加剂组分均呈良好线性关系，见表1。
表2 相关性分析 检测项目 安赛蜜 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 脱氢乙酸 范围（mg/L） 0.0-2.0 0.0-2.0 0.0-2.0 0.0-2.0 0.0-2.2 回归方程 y = 58320x - 1020.7 y = 77893x - 1367.9 y = 110188x - 1896.1 y = 46719x - 2310.7 y = 117808x - 30631 相关系数 方法检出限（mg/L） 0.9999 1.0000 0.9999 0.9997 0.9931 0.0175 0.0176 0.0172 0.0495 0.2600 2.3 精确度试验 对同一蛋白饮料进行六次平行试验，其结果如表2所示。
表3 精确度试验 检测项目 安赛蜜 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 脱氢乙酸 样品测定值 1 0.4662 0.4275 0.4141 0.3926 0.3788 2 0.4662 0.4106 0.4027 0.3722 0.3856 3 0.4699 0.4464 0.4056 0.3830 0.3858 4 0.4703 0.4184 0.4077 0.3741 0.3970 5 0.4705 0.4406 0.4052 0.3805 0.3935 6 0.4672 0.4425 0.4064 0.3974 0.4104 平均值 0.4684 0.4310 0.4070 0.3833 0.3919 RSD% 0.44 3.36 0.95 2.61 2.84 2.4 准确度试验 在同一不含五种食品添加剂的蛋白饮料中，加入这五种标准物质，加入后的浓度分别为：安赛蜜0.50mg/L、苯甲酸0.40mg/L、山梨酸0.40mg/L、糖精钠0.40mg/L、脱氢乙酸0.44mg/L，采取五平行试验。平均回收率分别为安赛蜜93.68%、苯甲酸107.33%、山梨酸101.74%、糖精钠95.59%、脱氢乙酸88.05%，其结果处于85到110之间，结果可信。 3 结论
本文通过对蛋白饮料前处理方法的改进，建立了可靠性高、操作简单、可准确同时测定常见五种添加剂的HPLC检测方法。此方法能够满足实际工作需要，为基层检验机构和企业提供了一种新的检验方法。 参考文献：
[1] GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法[S].
[2] 车燕妮，苏秀娟，刘新荣，徐莉，张化江. HPLC法快速测定食品中糖精钠、苯甲酸、山梨酸和咖啡因[J]. 理化检验(化学分册)，2005，41(1):2-4.
[3] 车燕妮，苏敬武，刘新荣，苏秀娟，徐莉. 常温液相色谱法快速测定食品中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠[J]. 预防医学文献信息，2004，10(3): 309-311. [4] GB/T 21703-2010 乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定[S].
[5] 张宗辉. 高效液相色谱法测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠样品前处理方法[J]. 预防医学情报杂志，2011，27(6):480-482.