发布时间 : 星期五 文章基因工程考试复习资料更新完毕开始阅读5e2b842c5b8102d276a20029bd64783e09127d3d
2012级《基因工程》考试复习 姓名：__________电话：___________
一
基因工程是指将一种或多种生物体 (供体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体 (受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.
基因工程 是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。
基因工程三要素：供体 受体 载体 基因工程的操作步骤：切→接→转→检
基因工程研究的内容：
基因的分离与克隆 转化体的筛选 [书本]:（GE克隆载体的研究 载体的选择与构建 外源基因整合和表达的检测 GE受体系统的研究 基因转化受体系统的建立 外源基因在细胞中的表达调控 目的基因的研究 基因转化技术 外源基因的遗传 GE工具酶的研究 GE新技术的的研究）
基因工程诞生的理论基础及技术基础 1)理论基础
20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。
50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。
50年代末和60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。 2）技术基础
限制性核酸内切酶的发现 DNA连接酶的发现 GE载体的发现 转化（导入）方法
基因表达
6如何正确看待基因工程(正反两方面）
虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：
①红色GE:指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。 ②白色GE:包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。
③绿色GE:在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。
但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：
问题1用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。
问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。 问题4转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。 问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。
二
DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体） 原核基因组DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。
植物组织中DNA 的提取CTAB的 作用 :
CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液[0.7mol/LNaCl]中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度[0.3mol/LNaCl]时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
动物组织中DNA 的提取SDS的 作用 : 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；
溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；
SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-?R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。 载样缓冲液的作用①增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.
质粒DNA提取的两种方法：氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91
氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。
原理：当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。 碱变性法提取质粒DNA方法及原理
碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH12.0~12.5时，线性的DNA会完全变性分开，甚至出现断裂；而共价闭合环状质粒DNA虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开。通过冷却或恢复中性pH使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，在离心时，大部分主染色体与细胞碎片、杂质等缠绕在一起被沉淀，通过离心即可除去线性染色体，而可溶性的cccDNA留在上清液中，将含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。
DNA样品浓度的测定方法
a,在琼脂凝胶上用荧光染料进行标准比对。 b，利用分光光度计测吸收值。A260.
DNA Concentration（浓度） Measurement
Comparison with a standard using a fluorescing dye （荧光染料）on an agarose-gel琼脂糖胶凝 .
Using absorption of DNA in a UV-spectrophotometer分光光度计
DNA纯度的测定
DNA在260纳米处有最大吸收峰，但蛋白质核酸的主要污染源在280nm处有最大吸收峰，A260/A280适合纯度测定。 纯DNA=A260/A280=1.8 纯RNA=A260/A280=2.0
低于1.8含苯酚或蛋白质，高于1.8含RNA和单核苷酸。 DNA纯化的方法：
a 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法（CsCl-EB）适合纯化大剂量DNA。 b 阴离子交换层析法
c 琼脂糖凝胶电泳洗脱法，适合小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收纯化。 d 基因纯试剂盒
核酸杂交类型： A转移印迹
southren杂交：检测DNA Northren杂交：检测RNA Western杂交：检测蛋白质
B 点印迹、狭缝印迹[dot blotting /slot blotting ] C 原位杂交[in situ hybridization]
质粒特性：
1什么叫质粒
一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。 2质粒的构型，及不同构型的大小迁移顺序
绝大多数质粒是环状双链，其分子具有3种不同的构型： 1）当其两条多核苷酸链均保持着完整的环状构型时，成为共价闭合环形DNA，即cccDNA。这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型。
2）如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环状结构，另一条出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型。
3）若质粒DNA经过适当的限制酶切割后，发生双链断裂而成线性分子（L-DNA)，通称L构型。
在正常的电泳条件下，不同构型的质粒DNA，尽管分子质量相同，但是仍然具有不同的电