发布时间 : 星期六 文章Western Blot实验详细步骤更新完毕开始阅读6183b4e8ff00bed5b8f31d4f
Western Blot实验技术
一、制胶
SDS-PAGE分离胶配方表
1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样
1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳
四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白
质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的
不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（ 转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。）
1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）
转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h （注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。）
五、封闭
在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA效果更好）倒好。
2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。
3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。
六、一抗
抗体反应主要采用间接法:
即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二抗物质有放射性核素，酶，以及生物素等。
1、将封闭后的杂交膜，在摇床上用TBST洗膜3次×5min， 2、加入经TBST稀释的一抗（用血清封闭液）
3、4℃孵育过夜或室温摇动孵育2-4小时回收一抗稀释液
七、洗膜
1、之后，在摇床上用TBST洗膜3次×5min，
八、二抗