发布时间 : 星期二 文章植物根和根际的研究方法更新完毕开始阅读61eb5886b9d528ea81c779a6
容器故于液氯中冰冻，再用切片机切成薄片，以供测定。
该装置存在一定的缺陷：由于土壤体积较小，缺乏缓冲性，当蒸腾作用强烈时，植物易萎蔫。
Gahoonia和Nielsen(1992)采用改进的根垫法培养装置。研究了控制条件下植物的根际动态。利用该装置可准确获取距根表不同距离的根际土。首先植物在装置(a)的PVC管子中预培养10天。管子的底部用细尼龙筛网封住，防止土壤污染根系。通过两个黑色PVC膜包裹的吸水纤维绳供应营养液，当根垫形成时(大约生长9天)，移去纽尼龙筛网，将预培养形成的根垫转移到测试土柱上(装置(b))，新的土柱的上湖53?m的尼龙筛网封住，以防止根系进人士住，根垫在l㎝的土层中快速生长，在53?m的尼龙筛网上形成新的根垫。为了保证—定郎土壤含水量，土柱被放置在含水的沙层上，沙层通过吸水纤维绳与供水装置相连。采集根际土壤时，将土柱从根垫下取出，在液氯中冷冻，用切片机切取距根表不同距离的根际土样品。
(5)根箱模拟根际方法 利用根箱模拟方法不仅可以直接观察和记录根系的生长参数，而且还可以通过直观的显色反应研究根际生物学和化学过程的变化，如根分泌物的释放、pH和Eh的变化等。根箱模拟方法可以严格控制试验的处理，模拟自然土壤中根系的生长情况，因而能比较真实地反映根际的动态过程。根箱模拟装置的种类较多，除了采集根际土的三室根箱装置，这里重点介绍用来观察根系生长、进行根际测定或显色过程的根箱模拟方法；植物种植在装有土壤的根箱中，根箱的大小依植物的大小来确定，为了使根系沿透明有机玻璃板生长，根箱的厚度应控制在l-2㎝的范围，并且使根箱的有机玻璃板面朝下，根箱与水平方向成45°夹角，根系由于重力的作用将沿着透明有机玻璃板的板面生长。在植物生长过程中，应用不透明的黑纸遮住透明有机玻璃板，保证根系在黑暗中生长。观察根系时，取下黑纸，用透明胶片和彩色记录笔描绘出根系的生长轨迹，通过扫描软件计算根系的生长速率和总长度。如果需要对根际的pH值、Eh或其他反应进行显色，首先制备琼脂板，然后打开根箱前面的透明有机玻璃板，使根系暴露在外(为了保证根系不失水，可用微型喷雾器在根表喷洒少量的雾滴)，把预先推备好的含有指示剂或其他染料的琼脂板轻轻地平铺在根系的表面，用塑料布覆盖整个装置以保持水分，减少水分蒸发对显色反应的影响，培养一定的时间后，琼脂板在根系生理反应的作用下就会显色，可以直观观察根际动态的变化（如根际pH值、Eh变化），也可以对颜色进行数字化处理和分析，定量描述根际过程或根分泌物释放的速率。 （三）菌根际研究方法
1．根箱培养系统
（1）三室根箱培养系统 中国农业大学的李晓林教授在研究菌根际的作用范围时，设计了三室根箱培养系统。植物种植在中室中，受菌根侵染的根系在中室中大量生长，根系不能穿过中室两侧的尼龙网膜(孔径30?m)，而菌丝可以穿过尼龙网膜进入外室生长。李晓林采用这种方法证明了丛枝菌根真菌菌丝可穿过根际区，生长到根外12㎝远的区域，将根系自身吸收土壤磷的范围增大了60倍，这是菌根促进植物吸收和利用土壤磷的重要机理。
(2)五室根箱培养系统 为了准确研究菌丝际养分的动态，在三室根上，建立了五室根箱培养系统(Li，et a1，1991)，与集束平面根法一样，通过五室根箱培养系统创造出集束菌丝平面，测定距菌丝平面不同距离的养分消长情况，以探讨菌丝际养分的动态。与三室根箱培养系统类似，受菌根侵染的根系在中室中大量
生长，菌丝可以穿过尼龙网膜进入外室生长，形成菌丝室，而根系不能穿过中室两侧的尼龙网膜(孔径30?m)。在菌丝室与员外层的土壤室之间隔有一层更细的网膜，菌丝不能通过，这样在0.4?m网膜的表面形成了菌丝集束面；可以用这样的方法精细研究菌根际养分的动态。
2．玻璃珠培养方法 研究菌丝最大的困难是难以获得大量的纯净菌丝，中国农业大学李晓林的菌根研究小组建立了以玻璃珠为介质的AM真菌培养方法，克服了以往难以获得足量干净苗根真菌材料的技术障碍，使菌丝的化学成分定量研究成为可能(Chen，et a1，2001)。试验的装置，受菌根侵染的植物根系生长在盛有土壤的外室中，根系不能穿过两侧的尼龙网(孔径30?m)，而菌丝可以穿过尼龙网进入缓冲室—河沙室，随着菌丝的继续生长，菌丝进入盛有玻璃珠的中室，并大量生长，植物培养一定时间之后，收获玻璃珠室中的纯净菌丝，记录菌丝的重量，并分析菌丝的化学成分。玻璃珠培养方法为菌丝的生物学研究特别是菌丝解剖、分子生物学和吸收养分的生理机制等基础研究提供了重要的菌丝采样技术，这种方法已被国际上广泛采用。
(四)根际原位研究—显色方法 根际非破坏性原位研究技术正在得到广泛应用，最典型的例子是根际的原位显色技术。利用这种技术能够准确并直观地确定根分泌物释放的部位或根际反应的部位。目前，多种显色技术已经在根际化学变化的检测中得到了应用。显色试验技术一般包括湿色剂和载体两大部分，显色剂是指pH、Eh指示剂或酶反应底物，载体常为琼脂板、聚丙烯酰胺膜、滤纸或层析纸。把含有显色剂的载体平板或膜放在液培或土培植物的根系表面，这种方法是定性或半定量的测定技术，在某些情况下，也可以完全定量评价根际化学过程的变化。
1 根际Eh的原位显色
(1)根际三价铁的还原 基本原理是BPDS（红菲罗啉）可以与Fe2+形成红色复合物。将 Fe(Ⅲ)EDTA(100?mol/L)和BPDS（300?mol/L）溶于7.5g/L的琼脂溶液中（Marschner，et al，1982），将含有Fe3+和BPDS的琼脂板放在根系的表面，或者把植物的根系浸入此溶液中，培养一段时间后，Fe3+的还原会导致红色复合物F2+-BPDS的形成，显色过程为30min至数小时。
(2)根际锰的还原 基本原理是把KMnO4加入7.5g/L琼脂溶液中，形成1mmol/L KMnO4 溶液，在50℃下培养2h，诱导MnO2的形成，然后将琼脂片放在根系表面，MnO2的还原会导致棕色的琼脂片褪色，显色时间一般为一天至数天。
2 根分泌物络合铝的原位显色 基本原理是Aluminon与Al3+形成红色复合物。将含有Al-Aluminon的琼脂片放在跟表面上，根分泌物中的有机络合物与Al-Aluminon竞争Al3+导致琼脂的褪色。
3根际酸性磷酸酶的显色 基本原理是酸性磷酸酶可以水解底物1-naphtyl phosphate，形成的产物1-naphtol与染色试剂Fast Red TR（diazotized 2-amino-5-chloro-toluene-1，5-naphtalene disulfonate）反应形成红色的复合物。
4根际磷活化的显色 基本原理是用含有磷酸钙的琼脂溶液作为植物生长的介质，植物活化和吸收磷酸钙以后，磷酸钙吸收区变为透明的区域，指示出植物根系活化和吸收的部位。 （五）示踪技术在根际中的应用 放射性自显影法是一种光化学过程。用作示踪的放射性核素所产生的射线使乳胶感光形成潜影，经显影、定影处理，就可将
已形成潜影的银离子迅速还原为黑色的银颗粒，而溶去未形成潜影的银离子，出现图像。
放射性自显影法具有的最大特点，主要是能定位放射性示踪剂在样品中的准确分布，生动、直观，比起基于电离和闪烁作用的放射性探测只能测定整个样品进入探测器灵敏区的总放射性有很大的优越性。随着核子乳胶、组织制片及观察技术的发展，该项技术逐渐从宏观自显影，发展到能精确定位微观区域中的放射性物质的存在与分布。放射性自显影的探测效率较高，可累积地记录人射的放射性，在植物生长过程中可以反复地“自象”，借此观察养分随时间的变化过程。此外，这种方法操作方便，设备简单，研究资料便于长久保存。它的局限性是：定量上误差较大，只能作相对定量，只能得到一个总量的概念，对养分的状况无法区分；测定速度低，在微弱的放射性条件下需要很长的曝光时间等。这使该技术在应用上受到一定的限制。
一般微观放射性自显影方法 根际微区属于微观研究范畴，这里简单介绍微观放射性自显影方法。
1 微观自显影方法的特点是需要把试验材料制成切片，感光材料是专用的核子乳胶，获得的放射性自显影在光学显微镜或电镜下进行显微观察，即能显示出放射性示踪剂在微域范围内的分布。此法具有较高的分辨力，其操作程序一般是：用放射性示踪剂标记试验材料，制备切片，施行乳胶，干燥，曝光，化学加工（显影、定影、水洗)，显微观察等。
这种微观自显影一般适用于生物体，试验样品制成组织切片、细跑涂片或薄切片，要求较高。乳胶层也要很薄，所以一般多用液体核子乳胶、较薄的乳胶干板或温底乳胶。在根际研究中可以借助平面根培养法进行微观自显影。平面根培养法是研究根际养分耗竭，根系吸收特性的手段。这种方法需要特制的，形似竖立的扁平的培养盒(箱)培养植株；这种培养盆一般用有机玻璃板制成，其大小根据试验的需要确定，如有效体积为20㎝×20㎝×1㎝可装土600g左右。在内培养室外再加上外室，分为内外两层，外室作为防护层。外室除一面是有机玻璃板(3㎜)制成的观察面外，其他各面均采用聚氯乙烯硬质塑料板，用塑料粘胶贴合在一起。内室的直径比外室的直径略小；有机玻璃板的顶端带有提环，便于内室与外室密合而又能方便地插入和抽出。把用放射性示踪物标记过土壤充填到内室中，栽种上作物，即可以在一定生育期做纵向或宏观的放射性自显影，还可以对根际区的根系和土壤进行联合冰冻切片，对根际标记养分的耗竭状况进行微观自显影观察。
微观自显影的几个基本方法是接触法、湿贴法、湿贴—接触法、液体乳胶法等。其中以接触法最为简便，即将乳胶干板或X光胶片的乳胶面面对切片，紧密接触，曝光后，进行化学处理，获得自显影片。它的缺点是分辨率低，不能作高倍镜观察。液体乳胶法是目前应用较为广泛，效果较好的方法—用滴加涂布法或浸膜法将液体乳胶直接加在载玻片的组织切片上，使之均匀铺开，晾干后连同标本一起进行曝光、显影、定影等，即可获得自显影片。
2 薄层标记的自显影法 在国内目前还没有低能放射性核素生产的情况下，改善自显影技术的一个途径是采用“薄层法”制备标本，以提高自显影的分辨率和清晰度。“薄层法”的具体做法是：根据作物根系的大小，试验时间的长短，制作与前述平面根培养法类似的培养箱，扁平直立。用于苗期生长规格可为20㎝×5.5㎝×1㎝或34㎝×9cm×1㎝，没有外室，盒的正面为能移动的有机玻璃板，其余各面可用不透明塑料板制作，狭窄底面每隔4cm设一进水孔。
标记土的制备方法是，分别称取通过80目的土壤42g或12g(大、小生长盒)，按1：1的土水比调成泥浆。按照试验目的和要求加入示踪物质。浸泡24h，充分搅拌平衡，烘干，磨细，过100目筛，作薄层涂片用。
育苗时在大、小生长盒底层垫上滤纸，分别加入通过40目的含有与标记土相同肥料的干土120g或40g，压实，使容重在1.3g/mL左右。加入20%干土重的水分，平衡后用玻璃板压平土面。
作簿层涂片时，在底土平面上均匀加入5％干土量的水分(可用注射器加入，或用滤纸浸润)，稍平衡后，用软性底纹笔将标记土均匀涂布于其上(厚度l-1.2㎜)。
做放射性自显影时，在暗室条件下将X光片放置于标本的有机玻璃板尼龙薄膜上，曝光，并经过化学处理，取得“自象”。
（六)根际的微电极研究方法 即把特制的微电极插入土壤的各个部位，以测定这些部位的pH、Eh、电导和养分等的方法。土壤本身具有不均一性，生长在土壤中的植物，在受土壤影响的同时，其生长也引起土壤性质的一系列变化，尤其是近根土壤与土体间的化学性质的差异。由于微区的研究要求测定范围小，分辨率高，也要求有一定的精确性，尤其是养分状况要求保持原位，因此，根际测定的精度在很大程度上取决于测定技术。早在1938年，就有人利用微电极研究土壤微区的pH状况。接着有许多报道是在根际微区的氧化还原状况方面的微电极应用。近年来，微电极在土壤性质、植物营养及土壤—植物相互关系的研究中得到了越来越广泛的利用。例如，于天仁等用其研究土壤的氧化还原电位、pH值、铵态氮等的微域变化规律，许曼丽等用锥形微钾玻璃电极测定根区土壤钾素状况等。此外，还有对植物细脑膜电位的测定报道。
微电极一般指敏感尖端直径以微米计的微型电化学传感器。直径＜0.5?m者为超微电极，最小的微电极尖端直径仅为0.04?m。微电极法在原理上与通常的大电极法并没有差异，只是由于电极很小，所以在电极制造和测定技术方面存在着一些特殊问题，如有些操作应在放大镜下进行等。这种方法的优点是：它可以原位地连续测定根际微区的养分环境状况；减少由取样、提取等分析步骤带来的误差；微电极法分析仪器结构简单；操作方便，易实现自动化；测定的是离子活度的函数而不是浓度，能代表扩散层中的离子数量以及对植物直接有效的离子数量，更能说明问题；由于微电极的敏感尖端可以做得很细微，可以直接插入活体甚至细胞内检测等。因此，在根—土界面这样的微域研究中微电极应用是很有发展前途的。当然，微电极在原位测定上还存在不少问题，特别是应用到土壤这样一个复杂的体系，干扰因素较多；更容易在测定时出现这样那样的问题，因而在所测定的结果的解释上需要很慎重。
由于篇幅有娘，这里仅就常用的微铂电极、微甘汞电极、微钾玻璃电极和微锑玻璃电极做简单介绍。
1 微铂电极 微铂电被属于金屑基电极中的零类电极，即惰性金属电极。这类电极包括金屈惰性金属电极或碳电极：；它们浸在含有能发生氧化还原反应的氧化态和还原态物质的均匀溶液中，即构成氧化还原电极。
微铂电极在制作技术上的关键问题，是获得微小的尖端和优良的绝缘。绝缘方法有两种：绝缘物覆盖法和玻璃封合法。
2 微甘汞电极 微甘汞电极是配合微铂电极或微银—氯化银电极作为参比电极用的。微甘汞电极是电化学测量中最常用的参比电极，是一种对氯离子响应的第二类电极，由汞、氮化亚汞(甘汞)和氯化钾溶液组成，可表示为