发布时间 : 星期三 文章食品化学基础实验汇总 - 图文更新完毕开始阅读63eef4e9ccbff121dc368310
1．标准蛋白质：5种蛋白质混合标样，分子量15kd、29 kd、45 kd、66 kd、97 kd、205 kd 2．30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，棕色瓶4℃ 保存。
3．分离胶缓冲液（1.5mol / L Tris , pH8.7 ) Tris 15.17g，适量水溶解，然后用lmol/ L HCI 调pH 值至8.7，定容至100ml。 4．浓缩胶缓冲液（0.5mol / L Tris-Hcl , pH6.8 ) Tris 6.06g ，适量水溶解，然后用 lmol / L HCI 调pH 值至6.8，定容至l00ml。
5．电极缓冲液Tris 6g , Gly28.8g , SDS 2g ，去离子水溶解后，用Hcl 调pH 值至8.3，水定容至2000ml 。
6．10%SDS：取10g SDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。 7．10%过硫酸铵溶液（AP）：临用前现配。
8．考马斯亮蓝染色液:0.1% 考马斯亮蓝R250、50% 乙醇、10% 冰醋酸,2000ml 9．脱色液:10% 乙醇、10% 冰醋酸,5000ml。 10．提取缓冲液：浓缩胶缓冲液稀释10倍
11.样品缓冲液：H2O 24ml，浓缩胶缓冲液12ml、甘油16ml、10%SDS 32ml，2-巯基乙醇4ml，溴酚兰0.08g。
12．TEMED（四甲基乙二胺）
13．2％琼脂2g 琼脂加电极缓冲液100 ml，水浴中溶化。 【操作步骤】 1．安装制胶模具。玻璃板要先用洗液浸泡, 然后用热水冲洗, 再用蒸馏水冲洗, 直立干燥。洗净的玻璃板装入硅橡胶套内, 垂直地固定在两半槽之间。注意在固定时要按照一定的顺序( 对角线方向) 同时拧动固定螺丝, 用力要均匀, 不能用力过猛或先拧紧一个再拧第二个, 否则电泳槽受力不均,会将玻璃板压碎或者造成胶液渗漏。电泳槽装好后, 将溶化的1.5% 琼脂注入背面槽内的小池中, 使胶池的下部凝成0.5 cm 厚的琼脂层, 备下一步使用。
2．根据所测蛋白质的相对分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按下表所列的试剂用量配。本实验配制10%分离胶，溶液在加入过硫酸铵与TEMED前应抽气，制胶过程防止空气混入。加入过硫酸铵后迅速混匀，灌胶。
分离胶的配制
试剂（ml）/分离胶浓度 H2O 30%丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 10%SDS TEMED 10%过硫酸铵 总体积 7.5% 4.90 2.50 2.50 0.10 0.02 0.5 10ml 10% 4.10 3.00 2.50 0.10 0.02 0.5 10ml 15% 2.40 5.00 2.50 0.10 0.02 0.5 10ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层乙醇。将胶板垂直放于 室温下，待分离胶聚合完全后，倾去乙醇并用滤纸吸干。 3．浓缩胶的制备
按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合的分离胶上，立即插入梳子， 将凝胶垂直放于室温下聚合。本实验配制4%浓缩胶，要求同分离胶配制。
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浓缩胶的配制
试剂（ml）/分离胶浓度 H2O 30%丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10%SDS TEMED 10%过硫酸铵 总体积 3% 3.2 0.5 1.25 0.05 0.05 0.3 5ml 4% 3.05 0.67 1.25 0.05 0.05 0.3 5ml 6% 2.7 1.0 1.25 0.05 0.05 0.3 5ml 4．样品提取与预处理：取鹰嘴豆粉0.5g,5ml提取液匀浆，12000rpm离心5mins,上清液0.25ml与等体积样品缓冲液混合，100℃加热5分钟。
5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，上下槽各加入电极缓冲液。 6．加样：用微量进样器加样。每个样品孔加入30ul样品。
7．电泳：浓缩胶：15mA；分离胶：30～50mA或100～150V。直至溴酚蓝达到距胶底部2cm，关闭电源。（回收电极缓冲液！可反复使用3次）
8．染色：从电泳装置上卸下玻板，小心橇开玻板取出凝胶，直接将胶片浸泡在考 马斯亮蓝染色液的染色盒中。95℃水浴中染色10min。 或在100℃水浴中分别染色 脱色处理同上。（染色液回收使用！）
9．脱色：移出凝胶放入脱色液中，每次95℃水浴中脱色5min，更换2次脱色液至本底无色为止。
10．结果：绘制电泳谱图或以照片形式打印出。标明溴酚蓝前沿和电泳方向。 10．MW 的计算
用直尺分别量出样品区带中心及染料与凝胶顶端的距离，按下式计算： 相对迁移率(mr )=样品迁移的距离(cm)/染料迁移距离(cm)。
以标准蛋白质的相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据等测样
品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。
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