发布时间 : 星期一 文章食品化学基础实验汇总 - 图文更新完毕开始阅读63eef4e9ccbff121dc368310
调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。
图4-2 薄层层析示意图
4.3.3 薄层色谱法基本操作
薄层色谱法与纸色谱法的基本操作相同，都包括点样、展开、显点定位等步骤，现分别概述如下。
（1）薄层板的准备 将吸附剂均匀地涂铺在大小适宜的平板玻璃或其它光洁表面上，待干燥活化后使用。现在有各种规格的预制板出售，买来即可应用，可省去制板步骤。
（2）点样 在薄层板的一端约1～3cm处点上样品溶液，待溶剂挥发后即可将薄层板放入槽内展开。
（3）展开 展开为使流动相溶剂沿滤纸或薄层板从点有样品的—端向另一端流动的过程。在此过程中，样品中组分被流动相带动前移，并由于与固定相的亲和力不同而得分离。一般进行薄层色谱时，通常可以立即以流动相展开，即使需用蒸气饱和时，一股时间也较短，展开时间较快。
（4）定位 经上述展开至溶剂前沿到达薄层板的另—端时，即可将薄层板取出，待溶剂挥干后用适宜方法确定组分斑点的位置，如观查荧光，喷以试剂使斑点显色等。由于一般薄层板材料多为无机物，所以可以使用各种显色试剂，包活腐蚀性较强的物质如浓硫酸等。纸色谱和薄层色谱法的优点之一是可以用多种方法显示斑点位置。
（5）定量 确定斑点位置之后，即可对其进行定量测定。可以将有斑点的薄层上吸附剂取下，用适当溶剂将该组分溶出洗下，再以适宜方法测定。近年来由于光密度计仪器的发展，已较广泛地用于纸色谱与薄层色谱斑点的定量测定。斑点不必洗脱，直接在光密度计上测量斑点的吸光值或荧光，并与标准品同样处理的结果进行比较，这样可以较快速、较准确地测定。
综上所述，纸色谱法和薄层色谱法的操作大体相同。相比之下，薄层分离所需时间较短，分离能力较强，斑点较集中，因此检出灵敏度较高。纸色谱分离后的斑点较为扩散，检出灵敏度不如薄层，展开时间较长也是它的一个缺点。但有些水浴性成分如糖、苷、氨基酸等用纸色谱法比用薄层法的分离效果好些。二者共有的优点是不需特殊设备，操作简便，可分析微克量的样品。
4.3.4 纸色谱及薄层色谱实验注意事项
（1）制板 薄层色谱分析时，制好的玻璃板应放于水平台上并注意防尘。使用前将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。
（2）点样 用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画
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一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，若要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm。底线距基线1～2.5cm，点间距离为lcm左右，样点与玻璃边缘距离至少lcm，为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1～2cm，再进行点样。
（3）展开
① 展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖。
② 展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。 ③ 点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。
④ 展开室应密闭，展距一般为8～15cm。薄层板放入展开室时，展开剂不能没过样点。一般情况下，展开剂浸入薄层下端的高度不宜超过0.5cm。
⑤ 展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。
⑥ 展开后的平板用适当的方法，使溶剂挥发完全，然后进行检视。
⑦ Rf值一般控制在0.3～0.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变流动相的比例。
（4）斑点的检出
展开后的平板经过干燥后，常用紫外光灯照射或用显色剂显色检出斑点。对于无色组分，在用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值(Rf值)来表示。化合物斑点中心至原点的距离与溶剂前沿至原点的距离的比值就是该化合物的Rf值。 4.4 柱层析的基本装置及基本操作
目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄
层层析的装置和操作将在后面详细讨论。 1. 柱层析的基本装置
2. 柱层析的基本操作
柱层析的基本操作包括以下一些步骤： （1）装柱
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50；
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凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。
将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N~1N）、碱 （0.5N~1N）、盐（0.5M~1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。 （2）平衡
柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。 （3） 加样
加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。
应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。 （4）洗脱
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种。
洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。 （5）收集、鉴定及保存
在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统
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的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。
（6）基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生
许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。
实验一、薄层层析分离分离纯化大豆极性脂类组分
一、 原理：
据油脂中各组分极性大小，利用薄层层析，以硅胶为固定相，有极性机溶剂为展开剂， 可将黄豆油脂中不同极性脂类组分进行分离。 二、实验材料：
黄豆粗油脂：螺旋榨法制备 三、 试剂与仪器：
1、 试剂：氯仿；展开剂：氯仿∶甲醇∶水（65∶25∶4，体积分数）；50%硫酸；硅
胶G；卵磷脂
2、 仪器：层析板；层析缸；毛细管；烘箱；研钵；玻璃棒；显色喷雾器；搪瓷托盘；
1%电子天平
四、 操作
1、 层析板制备与活化
秤取硅胶G15g,煅石膏1.5g，仔细研磨，以蒸馏水调成糊状（ ml）,均匀铺板，震荡使之薄厚均匀后晾干，200℃烘2小时。使用前100℃烘0.5小时活化 2、 样品制备
标样：卵磷脂1g,溶于2ml氯仿；样品：取新鲜黄豆油10g,溶于25ml氯仿 溶液待用。 3、 点样
活化后硅胶板冷却，在一端3cm处轻画一细线，用毛细管分别吸取少量标样与样品，分数次点在细线两端1/4处（标样与样品分别点在两侧）。点样斑大小以0.5cm直径为宜。晾干。 4、 展开
层析缸中加入1cm高度展开剂，盖玻璃板，轻轻晃动后平衡0.5小时。将层 析板点样端轻轻浸于展开剂中，密闭展开，待溶剂上沿运动至层析板上端1/4处时取出晾干。 5、 显色
将展开后层析板平铺在搪瓷盘中，均匀喷布50%硫酸，200℃烘10分钟，取 出照相。 五、 结果
在结果中标出组分数量，计算各自Rf值，各组分相对面积，标出样品中卵磷脂的位置。
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