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第五部分 电泳技术
凝胶电泳是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。
电泳的基本原理
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH 值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一，目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离；水平式电泳常用琼脂糖凝胶，应用于核酸检测。
由于pH 值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积：
F = q × E 上式中 q 是带电分子的净电荷，E 是电场强度。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F′）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F′的大小服从Stokes 定律，即：
F′=6πrηυ
式中 r 是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F’，
q·E = 6πrηυ
电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度：
m?q/ 6πrη
这就是迁移率公式，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不
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同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通 过放射性自显影等方法进行检测。
影响电泳分离的主要因素
由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素：
1. 待分离生物大分子的性质
待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 2. 缓冲液的性质
缓冲液的 pH 值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH 值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH 还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH 大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH 值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。 3. 电场强度
电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：
①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。 4. 电渗
由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH 基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH 值高于3 时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。
5. 支持介质的筛孔
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介 质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。
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电泳的分类
电泳按其分离的原理不同可分为： ⑴ 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带，这是当前应用最为广泛的电泳技术。
⑵ 自由界面电泳： 这是瑞典 Uppsala 大学的著名科学家Tiselius 最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。 ⑶ 等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。 ⑷ 等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH 梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH 处聚集成很窄的区带。 按支持介质的不同可分为： ⑴ 纸电泳
⑵ 醋酸纤维薄膜电泳 ⑶ 琼脂凝胶电泳
⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
按支持介质形状不同可它为： ⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳 ； ⑶ 柱电泳。
按用途不同可分为：
⑴ 分析电泳； ⑵ 制备电泳； ⑶ 定量免疫电泳； ⑷ 连续制备电泳。 按所用电压不同可分为：
⑴ 低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。
⑵ 高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、 核苷酸和糖类等小分子物质的分离。
纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳
纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。
纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH 2～3.5 的酸性缓冲液，分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀，点样位置是在滤纸的一端距纸边5cm～10cm 处。样品可点成园形或长条形，长条形的分离效果较好。点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极，电压通常使用2～10 V/cm 的低压电泳，电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质，则要使用50～200 V/cm 的高压电泳，电泳时间可以大大缩短。 醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似，只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。与纸电泳相比有以下优点：① 醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰。② 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小，吸水少，电渗作用小，电泳时大部分电流由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，完成全部电泳操作只需90 min 左右。③ 灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需 2ml 血清，点样量甚至少到0. 1ml，仅
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含5mg 的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④ 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤ 醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。
由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，是医学和生物化学的常规技术。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6 脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。
化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），使丙烯酰胺聚合成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。
光聚合催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照2 －3 小时即可完成聚合反应。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。
丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。
未加 SDS 的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和
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