发布时间 : 星期日 文章生物化学实验指导更新完毕开始阅读690df678852458fb760b560a
正比关系。该方法灵敏度高于双缩脲法100倍。对双缩脲反应有干扰的离子同样也容易干扰Lowry反应,并且影响更大.测定样品中如含酚类及柠檬酸均有干扰.甘氨酸、还原剂和二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇等会干扰反应。低浓度的尿素(0.5%左右)、胍(0.5%左右)、硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯乙酸(0.5%)、乙醇(5%)、乙醚(5%)、丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但浓度高时必须做校正曲线.含硫酸铵的溶液只需加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液即可显色测定,若样品酸度较高,显色后色浅,则必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1-2倍.
三、仪器与试剂
1.仪器：
分光光度计；水浴锅；试管；具塞试管8支；小烧杯2个；漏斗及架；分析天平；吸管：0.5ml×1，1ml×2，5ml×1；容量瓶：100ml×2,10ml×1；滤纸、玻棒等，研钵；离心机、离心管。
2.试剂：
（1）0.5ml/L NaOH （2）试剂甲
1）称取10g Na2CO3,2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500ml。 2）0.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解后，用蒸馏水定容至100ml。 每次使用前将A液50份和B液1份混合即为试剂甲。此混合液的有效期只有1天，过期失效。
（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO4·H2O），25g钼酸钠（Na2MO4·H2O）及700ml蒸馏水，再加50ml 85％磷酸，100ml浓盐酸充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水和数滴液体溴，开口继续沸腾15min,驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍呈绿色，须再重复滴加液体溴数滴，再继续沸腾15min，驱除过量的溴。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L盐酸。
3.材料
绿豆芽或其他植物材料(也可考虑用其它蛋白质样品)。
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制
（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.025g结晶牛血清白蛋白，倒至小烧杯内，加入小量蒸馏水溶解后转入100ml容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶内，最后用蒸馏水定容至刻度，配制成标准牛血清白蛋白溶液，其中牛血清白蛋白的浓度为250μg/ml。
（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取具塞试管6支，按下表加入牛血清白蛋白溶液及蒸馏水。然后各管加入试剂甲5ml，混合后在室温下放置10min，再加0.5ml试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，与其他5支试管内的溶液依次用分光光度计于500nm波长下比色。记录各试管内溶液的吸光度。
试剂 250μg/ml牛血清白蛋白 H2O (ml)
管 号 1 0 1.0 2 0.2 0.8 8
3 0.4 0.6 4 0.6 0.4 5 0.8 0.2 6 1.0 0 蛋白质含量（μg） 0 50 100 150 200 250
（3）标准曲线的绘制：以吸光度为纵坐标，以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。
2.样品测定
（1）称取绿豆芽下胚轴1g于研钵中，加蒸馏水2ml匀浆。转入离心管，并用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，并入离心管。4000r/min离心20min。弃去沉淀，上清液转入容量瓶，定容至10ml(当用其它蛋白质样品进行测定时,所用试剂和处理方法应作相应调整)。
（2）取具塞试管2支，各加入上清液1ml，分别加入试剂甲5ml，混匀后放置10min，然后加试剂乙0.5ml，迅速混匀，室温下放置30min，于500nm波长下比色，记录吸光值。
五、结果处理
从标准曲线上查出测定液中蛋白质的含量X (μg)，然后计算样品中的百分含量。 样品中蛋白质含量（％）＝
X(?g)?稀释倍数×100
样品重(g)?106六、注意事项
Folin试剂（试剂乙）仅在酸性条件下稳定,但上述还原反应是在pH10条件下发生,故测定操作中加Folin试剂到碱性的铜-蛋白质溶液中时,需特别注意立即混匀,以便在磷钼酸和磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应能够发生,否则显色程度减弱。
本法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量分析。
实验五、紫外分光光度法测定蛋白质含量
一、目的和要求
1.了解紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2.了解紫外分光光度计的构造原理．掌握它的使用方法。
二、原理
由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质．吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用。此法的缺点是：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质．会出现较大的于扰。
不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的．即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。
三、试剂与器材
9
1.标准和待测蛋白溶液 (1)标准蛋白溶液
准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液 (2)待测蛋白溶液
配制或稀释成浓度约为1mg/mL的溶液。 2.器材
紫外分光光度计，试管和试管架，吸量管。
四、实验步骤
1. 标准曲线法
（1）标准曲线的绘制
按下表分别向每支试管加入各种试剂,摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯．在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标淮曲线。
标准蛋白质溶液(1mg/mL) 蒸馏水(mL) 蛋白质浓度(mg/mL) A280 1 0 4.0 0 2 0.5 3.5 3 1.0 3.0 4 1.5 2.5 5 2.0 2.0 6 2.5 1.5 7 3.0 1.0 8 4.0 0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.75 1.00 (2)样品测定
取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2.其他方法
(1)将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度(mg/mL)＝1.45A280-0.74A260。
式中A280和A260分别是蛋白质溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。
此外，也可先计算出A280/A260的比值后，从表4.1中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。
蛋白质浓度(mg/mL)=F×
1×A280×N d式中A280为该溶液在280nm下测得的光吸收值；d为石英比色杯的厚度(cm)；N为溶液的稀释倍数。
(2)对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。从吸收差ΔA与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。
吸收差ΔA＝A215-A225
式中的A215和A225分别是蛋白质溶液在215nm和225nm波长下测得的光吸收值。
此法中,当蛋白质含量在20－100μg/mL的范围内时，服从Beer定律。氯化钠、硫酸铵
－1
以及1×10mol/L磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是1×10－1
mol/L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能
-3
应用，必须降至5×10mol/L才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而
10
有高低，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线制订时的pH一致。
表5.1紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子
(3)如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值[A1cm]，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，可直接求出蛋白质的浓度。
1%实验六、 酵母RNA的提取及其组分的鉴定
一、目的和要求
了解酵母RNA的提取及其组分鉴定的原理和方法。
二、原理
微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中以酵母最为理想。这是因为酵母核酸中主要含RNA（2.67％～10.0％），DNA很少（0.03％～0.516％），菌体容易收集，RNA也易分离。此外，抽提后的菌体蛋白质（占干菌体的50％）还具有很高的利用价值。
RNA提取过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，在根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将pH调到2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。提取RNA的方法很多，本实验采用浓盐法（10％NaCl）提取。得到RNA后，加硫酸煮沸即可使RNA水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸，从水解液可测出上述组分的存在。
三、试剂与器材
11