发布时间 : 星期日 文章生物化学实验指导更新完毕开始阅读690df678852458fb760b560a
现象 解释实验现象 五、注意事项
(1) 各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验3,4,5应随时检查反应进行情况。如反应进行太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。
(2) 酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量C1-。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。
实验八、脲酶Km值测定
一、实验目的
脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早已引起人们重视。通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。
二、实验原理
脲酶催化下列反应：
脲 酶
(NH2)2CO + 2H2O (NH4)2CO3
在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。
(橙黄色)
在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合反应。在
一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器
(1 ) 试管16×160mm 21支 (2 ) 吸管 0.5mL× 15，lmL × 1，2mL× 1，l0mL× 1 (3 ) 漏斗5个
(4 ) 721型分光光度计 (5 ) 电热恒温水浴 (6 ) 离心机
(7 ) 康氏振荡机
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2.试剂
(1) 1/10 mol/L脲：15.015g，水溶后定容至250mL。
(2) 不同浓度脲液：用1/10mol/L脲稀释成1/20、1/30、1/40、1/50 mol/L的脲液。 (3) 1/l5 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液：Na2HPO4 5.969g，水溶后定容至250mL。KH2PO4 2.268g，水溶后定容至250mL。取Na2HPO4溶液60mL，KH2PO4溶液40mL混匀。
(4) 10％硫酸锌20g ZnSO4溶于200mL蒸馏水中。
(5) 0.5 mol/L氢氧化钠: 5g NaOH，水溶后定容至250mL。 (6) 10％酒石酸钾钠: 20g酒石酸钾钠溶于200mL蒸馏水中。
(7) 0.005mol/L硫酸铵标准液：准确称取0.6610g硫酸铵，水溶后定容至1000mL。 (8) 30％乙醇: 60mL 95％乙醇，加水130mL，摇匀。 (9)奈氏试剂
① 甲8. 75g KI溶于50mL水中。 ② 乙8.75g KI溶于50mL水中。 ③ 丙7.5gHgCl2溶于150mL水中。 ④ 丁2.5g HgCl2溶于50mL水中。
⑤ 甲与丙混合，生成朱红色沉淀。用蒸馏水以倾泻法洗沉淀几次，洗好后将乙液倒入，令沉淀溶解。然后将丁液逐滴加入，至红色沉淀出现摇动也不消失为止。定容至250mL。
⑥ 称NaOH 52.5g，溶于200mL蒸馏水中，放冷。 ⑦ 混合(5)、（6），并定容至500mL。上清液转入棕色瓶中。存暗处备用。
3．材料 大豆粉
四、操作步骤
(1) 脲酶提取：称大豆粉1g，加30 %乙醇25mL，振荡提取lh。4000r/min离心l0min，取上清液备用。
(2)取试管5支编号，按下表操作： 管 号 脲液 浓度（mol/L） 加入量（mL） pH磷酸缓冲液（mL） 37℃水浴保温（min） 加入脲酶（mL） 加入煮沸脲酶（mL） 37℃水浴保温（min） 加10％ZnSO4(mL) 加蒸馏水（mL） 加0.5mol/L NaOH（mL） 1 1/20 0.5 2.0 5 0.5 - 10 0.5 10.0 0.5 2 1/30 0.5 2.0 5 0.5 - 10 0.5 10.0 0.5 3 1/40 0.5 2.0 5 0.5 - 10 0.5 10.0 0.5 4 1/50 0.5 2.0 5 0.5 - 10 0.5 10.0 0.5 5 1/50 0.5 2.0 5 - 0.5 10 0.5 10.0 0.5
在漩涡振荡器上混匀各管，静置5min后过滤。
(3) 另取试管5支编号，与上述各管对应，按下表加入试剂（mL）： 管 号 1 2 3 4 5 17
滤液 蒸馏水 10％ 酒石酸钠 0.5mol/L NaOH 奈氏试剂 0.5 9.5 0.5 0.5 1.0 0.5 9.5 0.5 0.5 1.0 0.5 9.5 0.5 0.5 1.0 0.5 9.5 0.5 0.5 1.0 0.5 9.5 0.5 0.5 1.0 迅速混匀各管，然后在460nm比色，光径lcm。 (4) 制作标准曲线，按下表加入试剂（mL）： 管 号 0.005mol/L (NH4)2SO4 蒸馏水 10％ 酒石酸钠 0.5mol/L NaOH 奈氏试剂 1 0 10.0 0.5 0.5 1.0 2 0.1 9.9 0.5 0.5 1.0 3 0.2 9.8 0.5 0.5 1.0 4 0.3 9.7 0.5 0.5 1.0 5 0.4 9.6 0.5 0.5 1.0 6 0.5 9.5 0.5 0.5 1.0
迅速混匀各管，在460nm比色，绘制标准曲线。 五、结果处理
在标准曲线上查出脲酶作用于不同浓度脲液生成碳酸铵的量，然后取单位时间生成碳酸铵量的倒数即值。
六、注意事项
(1)准确控制各管酶反应时间尽量一致。 (2)按表中顺序加入各种试剂。
(3)奈氏试剂腐蚀性强，勿洒在试管架和实验台面上。
11为纵坐标，以对应的脲液浓度的倒数即为横坐标作双倒数图，求出Km
[S]V实验九、鱼细胞ATP酶活性的测定
一、实验目的
1. 了解测定细胞ATP酶活性的原理。
2. 学习测定ATP酶活性的操作方法。
二、实验原理
细胞中有多种ATP酶，它们存在于细胞的不同部位，能催化ATP产生无机磷，无机磷与钼酸根离子反应形成钼酸复合离子，在抗坏血酸还原作用下，被还原成深蓝色的钼蓝，在一定范围内，溶液蓝色深浅与磷酸含量呈正比，在测定条件下，每克组织每秒钟催化底物生
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成1nmol无机磷的酶量定义为一个酶活力单位。
三、器材与试剂
1. 器材
可见分光光度计、制冰机、移液管、量筒、超声波匀浆机、高速冷冻离心机、离心管、恒温水浴锅、电子天平、吸水纸、擦镜纸、鲫鱼（或其它材料）
2. 试剂
（1）50mmol/L咪唑—乙酸缓冲液（PH7.4，含250 mmol/L 蔗糖、5mmol/L EDTA） 称取咪唑1.7g 、蔗糖42.78g、EDTA0.93g 先溶于重蒸水中，用 1mol/L乙酸调节PH至7.4，定容至500ml。
（2）25mmol/L Tris-乙酸缓冲液 (pH7.4, 含6mmol/L MnCl2、100mmol/L NaCl、10mmol/LKCl )
取0.2mol/L Tris溶液 12.5ml、1mol/L乙酸16.25ml、MnCl2 0.24g、NaCl 1.17g 、KCl 0.149g 。加水至150ml，调节pH至7.4，定容至200ml。 （3）10mmol/L ATP溶液
称取ATP二钠盐0.276 g ，加水至50ml。 （4）20% (m/V) 三氯乙酸 （5）定磷试剂
在使用前取去离子水、6 mol/L 硫酸、2.5%钼酸铵溶液、10%抗坏血酸溶液，按2：1：1：1的比例混匀，混合液应为淡黄色，如呈棕黄色则不能用。
(6) 4mmol/L KH2PO4溶液
称取KH2PO4 0.544g，用去离子水溶解，然后定容至1000ml。
四、实验步骤
1. 标准曲线的制作
取试管六支，编号，按下表依次加入试剂。
试剂
V(4mmol/L KH2PO4溶液)/ml V(去离子水)/ml V(定磷试剂)/ml 总体/ml 试 管 编 号
空白 0 2.0 2.0 4.0 1 0.2 1.8 2.0 4.0 2 0.4 1.6 2.0 4.0 3 0.6 1.4 2.0 4.0 4 0.8 1.2 2.0 4.0 5 1.0 1.0 2.0 4.0 将各试管同时放在45℃ 水浴中，保温20min，冷至室温，测定各管的吸光度A660，重复测定3次，并求其平均值。然后以测得的平均吸光度A660为纵坐标，对应的无机磷为横坐标绘制标准曲线，并求出标准曲线常数K值。
2. 取材
取新鲜活鲫鱼，先进行形态学测量，然后取其鱼肉，用重蒸水冲洗三次，吸水纸吸干备用（如时间允许，可以做其他组织）。
3. ATP酶活力的测定
（1）取上述鱼肉组织1 g ，加入6ml预冷的50mmol/L 咪唑—乙酸缓冲液（PH7.4，含250 mmol/L 蔗糖、5mmol/L EDTA），冰浴中用匀浆机匀浆。 （2）取匀浆液0.25ml 与25mmol/L Tris-乙酸缓冲液0.55ml混合在1.5ml的离心管中，25℃水浴保温20 min。
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