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（3）加入10mmol/L ATP溶液0.55ml，反应10min。
（4）加入20%三氯乙酸0.15ml终止反应，0℃, 12000r/min离心5min。
（5）取上清夜1ml，按制作标准曲线的工作条件，用钼蓝法测定无机磷，在660nm 波长下测定A660，并根据吸光度计算酶活性。
实验十、还原糖和总糖的测定（3，5－二硝基水扬酸比色法）
一、实验目的
掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉721型分光光度计的使用方法。
二、原理
各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。
在碱性条件下，还原糖与3,5－二硝基水扬酸共热，3,5－二硝基水扬酸被还原为3－氨基－5－硝基水扬酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅呈正比，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。
三、材料、仪器和试剂
1.材料：面粉 2.仪器：
（1）25mL血糖管或大试管×11 （2）三角瓶：100mL×2
（3）容量瓶：50mL×1，100mL×1
（4）量筒：25mL×1 (或碱式滴定管1支) ，10mL×1 （5）皮头吸管×1
（6）刻度吸管：2mL×3 ，10mL×2 （7）水浴锅：50℃×1 ，100℃×1 （8）天平
（9）分光光度计（721型） （10）烧杯:100 mL×1
（11）其它：滤纸×1，漏斗×1，试管夹×1，玻棒×1 3.试剂：
（1）1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
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（2）3,5－二硝基水扬酸试剂：将6.3g 3,5－二硝基水扬酸和262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，储于棕色瓶中备用。 （3）碘－碘化钾溶液：称取0.3g碘化钾溶于少量水中，加0.1g碘使溶解，定容至100mL。 （4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70％乙醇中。 （5）6mol/L HCl （6）6mol/L NaOH
四、操作步骤：
1.制作葡萄糖标准曲线
取7支具有25mL刻度的血糖管或刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3,5－二硝基水扬酸试剂。
管号 葡萄糖标准溶液(mL) 蒸馏水(mL) 3,5－二硝基水扬酸试剂(mL)
将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖mg数为横坐标，绘制标准曲线。
2.样品中还原糖和总糖含量的测定：
样品中还原糖的提取：准确称取1g食用面粉，放在100mL的三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加25mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20分钟，使还原糖浸出。将此液全部转入50mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤烧杯，并转入容量瓶定容，混匀后过滤（或离心），滤液（或上清液）为还原糖待测液。
样品中总糖的水解和提取：准确称取1g食用面粉，放在100mL三角瓶中，加入10mL 6mol/mL HCl及15mL蒸馏水，置于沸水浴中加热30分钟。取1～2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘－碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集入100mL的容量瓶中，定容。
精确吸取10mL定容过的水解液，移入另一100mL的容量瓶中，定容（即稀释10倍）混匀，作为总糖待测液。
3.显色和比色：
取5支具有25mL刻度的血糖管或刻度试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂。
将各管摇匀，在沸水浴中加热5分钟，取出冷却至室温，以蒸馏水定容至25mL（即加21.5mL H2O），混匀后，在540nm波长下，以作标准曲线时的0号管调零，测定各管的消光值。
管号 还原糖待测液（mL）
1 0 2.0 1.5 2 0.2 1.8 1.5 3 0.4 1.6 1.5 4 0.6 1.4 1.5 5 0.8 1.2 1.5 6 1.0 1.0 1.5 7 1.2 0.8 1.5 参比管 0 21
还原糖测定管号 ① 2 ② 2 总糖测定管号 I 0 II 0 总糖待测液（mL） 蒸馏水（mL） 3,5-二硝基水扬酸试剂（mL）
0 2 1.5 0 0 1.5 0 0 1.5 1 1 1.5 1 1 1.5 五、结果计算：
根据管①、②的平均消光值和管Ⅰ、Ⅱ的平均消光值，在标准曲线上查出相应的还原糖mg数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
查曲线所得还原糖mg数?还原糖％＝
提取液总体积测定时取用体积?100
样品mg数提取液总体积测定时取用体积查曲线所得水解后还原糖mg数?总糖％＝
样品mg数?0.9?100
六、注意事项：
1.离心比过滤易得清液。
2.标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。
实验十一、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
一、目的和要求
1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术
二、原理
以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，在催化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素和加速剂N，N，N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合交联而成的三维网状结构的凝胶(图11-1)。聚
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丙烯酰胺凝胶具有一系列优点：①化学性能稳定，一般不与被分离物发生反应；②样品不易扩散；③几乎无电渗作用；④在合适的浓度范围内，凝胶透明，机械性能好，易观察。因此，聚丙烯酰胺凝胶电泳被广泛应用于蛋白质等大分子的分离分析中。
为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面有一层浓缩胶。因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应，较厚的蛋白质加样层可以被浓缩成很薄的蛋白质层，使电泳具有良好的分辨率。
图11-1 聚丙烯酰胺的三维网状结构
三、材料、试剂和仪器
1. 器材
电泳槽、电泳仪、微量进样器、新鲜血清等。 2. 试剂
（1）1 mol/L HCl （2）丙烯酰胺(Acr.)
（3）N，N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis.)
（4）N，N，N’N’-四甲基乙二胺(TEMED) （5）过硫酸铵(AP)
（6）三羟甲基氨基甲烷（Tris）
（7）0.1%(m/V)氨基黑10B或1%(m/V)考马斯亮蓝R250 （8）40%(m/V)蔗糖 （9）蔗糖—溴酚蓝溶液
称取溴酚蓝50mg，溶于20%蔗糖溶液至100ml。 （10）甘氨酸-Tris电泳缓冲液(PH8.3)
称取甘氨酸28.8g，Tris 6.0g 加适量水溶解，调pH至8.3后，定容至1000ml。临用时稀释10倍。
（11）7%(m/V) 三氯乙酸 （12）7%(m/V) 乙酸
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