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第2章 基因克隆的载体——质粒和
噬菌体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
一、载体的功能：
1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
二、载体应具备的条件： 1.具有对受体细胞的可转移性
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记 附图：
图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式
2.1 质粒
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。
一、质粒的基本特性： （一）自主复制性
质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 （二）不相容性
利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 （三）可扩增性
质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。 但另外两种质粒（psc101和p15A）和的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。 （四）可转移性 在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。
二、质粒的构建
（一）天然存在的两种质粒
（1）colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell。
（2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcr质粒的命名 p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。
（二） 质粒人工构建的目的
天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：
（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组
（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。 三、质粒的分类
（一）根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类：
致育（fertility）质粒 /F质粒：仅携带转移（tra）基因，并且除了能够促进质粒有性结合的转移外，不再具备其他的特征，如大肠杆菌的F质粒。 耐药性（resistance）质粒 / R质粒：携带有能够赋予宿主细菌对某一种或多种抗菌药的耐药性的基因，如抗氯霉素、青霉素或水银。如RP4，发现于假单胞杆菌。
Col 质粒（col plasmid）：编码大肠杆菌素，一种能够杀死其他细菌的蛋白，如存在于E. coli 中的CoE1。
图3-2 利用抗性基因进行重组子的筛选
降解质粒（degradative plasmid）:使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的分子，如：甲苯，水杨酸，例如，假单胞菌中的TOL质粒。
毒性质粒（virulence plasmid）：赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的Ti质粒（Ti plasmid），能够在双子叶植物中诱导冠瘿瘤。
2.2 噬菌体
一、λDNA载体
（一） λ噬菌体的分子生物学
λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 1) λ-DNA的物理图谱
λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。例如，所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在左端1/3处；控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因；相关基因的聚集对λ基因组的表达是非常重要的，这能够使他们一起启动或关闭，而不是单独起作用。
图3-11 cos位点的作用
2）感染周期
噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入
（1）吸附 吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进λ噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）。 （2）DNA注入
（3）DNA复制 从单一ori区滚筒复制，形成线状多联体，λ-DNA上两个基因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。 （4）包装 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，