发布时间 : 星期一 文章第2章 基因克隆的载体 - 质粒和噬菌体 - 图文更新完毕开始阅读6a20ccff700abb68a982fb23
形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的。
包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状负责被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λ-DNA分子，包装对DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装λ-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。
（5）裂解 每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。
图3-12 λ噬菌体的侵染循环
3）溶源状态的建立
噬菌体感染大肠杆菌后除了可能裂解细胞外，也可能直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不裂解细菌，这种情况的为溶源状态，整合重要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使λ-DNA或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 （二） λ－DNA载体的构建
建立λ克隆载体前需要解决2个问题：
1） λDNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。 2） λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ基因组。 Ⅰ. 缩短长度
野生型λ－DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实λ－DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。
图3-13 λ－DNA的结构
Ⅱ.修饰酶切识别位点
天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。
图3-16 通过自然选择法筛选无EcorI识别位点的λ-噬菌体
（三）λ-DNA作为载体的优点
1) λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌 2) λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量
3) 重组λ-DNA的筛选较为方便
4) 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易 二、柯斯质粒（粘性质粒，cosmid） （一）柯斯质粒的构建
λ-DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA
片段，柯斯质粒就是应这种需要而人工组建的。
柯斯质粒顾名思义就是含有λ-DNA两端cos区的质粒。由于λ-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象λ-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。
图3-17 Cos质粒pJB8
（二） 柯斯质粒的优越性：
1) 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞
2) 可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA 3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选
4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。
图3-18 利用Cos质粒进行克隆
三、M13-DNA
（一） M13单链噬菌体的分子生物学
M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛
内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞的复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，滚筒式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100-200时，负链上的基于产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。
图3-19 M13噬菌体的侵染循环
（二） M13-DNA载体家族 1. M13mp载体家族
M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ'、多克隆位点，消除多余的酶切位点。在M13上引入lacZ’基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。
M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoRI位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2是最简单的M13克隆载体，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。 M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ’基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为polylinker，含有一系列的限制性位点和EcoRI粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoRI位点上，就产生了M13mp7。