发布时间 : 星期五 文章微生物学实验讲义 - 图文更新完毕开始阅读6e23b94d2b160b4e767fcf78
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
石碳酸复红染色液着色快，时间短，菌体呈红色；美蓝染色液着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色；草酸铵结晶紫染色液染色迅速，着色深，菌体呈紫色。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
（三）实验材料
1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。
2．染色剂：吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。 3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
（四）实验步骤 1． 涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，分别从以上菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上（图1－2）。
载玻片要洁净无迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2． 干燥
室温自然干燥或烘干。 3． 固定
涂面朝上，通过火焰2～3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
4． 染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。草酸铵结晶紫染色约1 min，或吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色1～2 min。
5． 水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
6． 干燥
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自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。 7． 镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
图1－2 简单染色无菌操作及涂片、干燥和热固定过程
图片说明：1.取接种环；2.将接种环放在酒精灯上灼烧；3.摇匀菌液；4.灼烧试管口；5a5b.取菌液或从斜面上取菌苔；6取菌完毕，再烧试管口，塞上棉塞；7a7b.涂片，从斜面上取的菌与载玻片的水滴混匀后涂片；8.涂片完毕，灼烧接种环；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干
（五）实验报告内容
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
（六）思考题
1. 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
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3. 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
三、革兰氏染色法
（一）目的要求
学习并初步掌握革兰氏染色法。
了解革兰染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
（二）基本原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christsin Gram氏创立，而后一些学者在此基础上作了些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。革培养氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。
革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。
（三）实验材料
1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。 2．染色剂：革兰氏染色液。 3．仪器或其他用具同实验一。
（四）实验步骤
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1．制片
取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。 性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2．初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2 min,水洗。 3．媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 4．脱色
用吸水纸吸去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 5．复染
用蕃红液复染约2 min，水洗。 6．镜检
干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。 7．混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。
（五）实验报告内容
列表简述2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。
（六）思考题
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 3．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
4．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
5．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
6．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳
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