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常见疫病实验室检测方法
(1:500), 每孔加 50 μl 封板 ,37 ℃温育 1 小时。
6. 同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液 (务必加双氧水),37℃温育15分钟。每孔再加50μl终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。
五 结果判定 1. 试验认可标准
每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.5±0.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:8。
2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)
抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。
3.结果判定
以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度＞1:128 。
ELISA抗体效价≥1:128,判定为亚洲 1 型口蹄疫抗体阳性。
ELISA抗体效价与保护力的关系:牛、羊:抗体效价≥1:128,99% 保护；效价≤1:16, 不保护；效价在1:22-90之间,50%保护。
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常见疫病实验室检测方法
猪瘟抗原检测试剂盒
Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit(CSFVAg)
概 述
猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)都是瘟病毒科黄病毒属的成员。
猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引起猪的严重死亡。感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。
猪也有可能感染BVDV或BDV。尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。
原 理
本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原。采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。形成的单克隆抗体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。通过酶标仪测定其吸光度。可以用450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。
试 剂
本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品(每个样品1孔，每个对照2孔)或46个样品(每个样品2孔，每个对照2孔)；或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品(每个样品2孔)。为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。
试 剂 数 量 1、多克隆羊抗血清包被板条 8孔×12条(96孔) 2、10倍浓缩样品稀释液(10x) 55ml 足以配制550mL直接使用的1x稀释液
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3、10倍浓缩洗涤液(10x) 125ml 足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度(1x) 4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂 4ml 5、阳性对照，含有防腐剂 1.5ml 6、阴性对照，含有防腐剂 1.5ml 7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物(100x)，
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含有防腐剂 200μl 8、酶标抗体稀释液 15ml 9、底物液，TMB/H2O2溶液 12ml 10、终止液，1M HCI(小心，强酸) 12ml 注意事项
1、仔细阅读并遵守操作说明；
2、试剂盒试剂于2～7℃冷藏保存。建议将浓缩的洗涤液(10x)保存在18～25℃室温，以免形成结晶。
3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。
4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于2～7℃冷藏保存。 5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。 6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。处理试剂时要小心。 7、不要用超过保质期的检测试剂盒。
8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。 9、每个样品都用单独的吸头。
10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。 11、配制试剂时只能用超纯水。 12、不要用嘴吸取液体。
13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，避免与皮肤和眼睛接触。
14、终止液为1MHCl，HCI为强酸并且能造成灼伤，小心处理。 15、本试剂盒只能用于体外诊断。兽医专用。 试剂配制
1、包被的反应板、猪瘟病毒特异性单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、底物溶液、终
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止液为现用试剂。
2、洗涤液
10倍浓缩洗涤液必须用超纯水或双蒸水进行10倍(1：10)稀释，稀释的洗涤液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；或冰冻保存，至少可以保存一年。例如：配制500ml稀释的洗涤液，将450ml超纯水或双蒸水加到50ml浓缩液中，混匀。注意：如果浓缩液有结晶，在使用前必须溶解。可将瓶子放在温水中30分钟以上。
3、样品稀释液
10倍浓缩样品稀释液必须用超纯水或双蒸水进行10倍(1∶10)稀释，但如果检测全血样品时，将适量的10倍浓缩液与等体积的超纯水混合，制成5倍浓缩液(5X)即可。将制备的稀释液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；或者冰冻保存，可以保存一年以上。
4、辣根过氧化物酶标记物(100x)
100倍(100X)浓缩标记物在使用前必须用标记物稀释液进行1∶100倍稀释。如果只使用部分试剂，只要用稀释液按100倍(1∶100)稀释足够本次使用的标记物浓缩液(旋涡振荡混勾)即可。稀释后的标记物溶液只能保存24小时。例如：10ml的辣根过氧化物酶标记物工作液，只需取100μl浓缩标记物(100X)加到10ml标记物稀释液中，在旋涡振荡器上混匀即可。 自备器材
1、精密移液器，5μ1至1000μ1 2、一次性移液吸头。 3、双蒸水或超纯水。 4、洗瓶或自动洗板机。 5、湿盒或封板胶带。 6、离心机，2000xg。 7、酶标仪。 8、离心管和小试管。 9、微量离心机，10，000xg。 10、旋涡振荡器。 11、剪刀和摄子。
12、0.17MNH4CI溶液，制备白细胞用。 样品制备
注意：制备好的样品或组织可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。但这
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