发布时间 : 星期五 文章一代至四代测序技术详细讲解 - 图文更新完毕开始阅读741c45fd8762caaedc33d415
挪威Lingvitae公司（http://www.lingvitae.com/DPTutorial.php）已经成功开发出了一种自动化的、 大规模并行处理方法。该方法可以在24小时内将一个人类基因组序列转化成由24bp寡聚体序列组成的“新”序列。现在，他们还在继续努力，希望能开发出更 便宜、出错率更低、寡聚体片段更长，同时耗时更短的信号转化方法。进行这种信号转化看起来是增加了一个步骤，这好像与纳米孔测序的初衷（不需要进行标记等 额外操作步骤）相悖，但实际情况是，由于增加了这个步骤极大地简化了后续的信号（序列）读取工作，而这点恰恰是令其它测序方法头疼不已的大麻烦。
使用两种能分别与A、B互补的12bp长的“分子信标”（molecular beacon）（详见
http://www.molecular-beacons.org/Introduction.html，杂交过程见图10）与经 过上述信号转化之后形成的新DNA链杂交。分子信标由于自我猝灭（self-quenching）机制的作用，在溶液中的荧光背景信号极低（图8c）。 同样，当分子信标与新DNA链杂交之后，由于临近信标间存在相互猝灭作用，所以荧光信号依然很弱（图8c）。但当杂交链通过直径不到2nm的纳米孔 时，与新DNA链互补结合的寡聚体会脱落，并释放出荧光信号，只需依次检测这些荧光信号就能对原始DNA链进行测序。将高密度纳米孔芯片技术、光学读取技 术、高分辨率电子倍增电荷偶联摄像技术（high resolution electron-multiplying charge-coupled device camera）结合起来，就可以同时并行处理大量数据，大大提高测序速度。由于纳米孔不需要借助电子吸附（electrical contact）、表面修饰（urface modification）或转位过程（translocation process）等步骤就可以装载到芯片上，因此可以得到极高密度的纳米孔芯片。现在的纳米加工技术（nanofabrication）已经可以达到上述 要求了。不过，目前要生产出直径在1.7nm~2.0nm的高密度纳米孔芯片还存在一定困难。
当单链DNA通过嵌有探针的固态纳米孔时检测横向隧穿电流或电容。有这样一种理论认为，当单链DNA通过嵌有探针的固态纳米孔时，通过每一个碱基的 横向电流都各不相同，故根据电流情况判断出是哪种碱基通过，也就能对ssDNA进行测序了（图8d）。这种方法与前面所述的因为每种碱基堵塞了纳米孔道导 致电流减小的幅度不同来对碱基进行判断的方法不同，它是检测横向装载在纳米孔道中的一对电极对通过纳米孔的碱基施加的横向电流来判断究竟是哪种碱基通过 的。虽然在试验中该方法的效果很不错，但是还是要介绍一下有关该方法的几种不同观点。
与在扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope, STM）中一样，使用合适的探针（电极），可以得到纳安级（nano-ampere）的电子隧穿电流。使用这种纳安级的电流检测碱基的速度比在直径不到 3nm的纳米孔中使用皮安级的电流检测要快得多。虽然这种方法只需使用纳米孔和电流检测设备，并有望成为最便宜、最快速的测序技术，但它也面临着四种主要 的挑战（表13）。
不过，现在使用单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotube）就有望解决上述第二和第三个挑战，如果对碳纳米管进行合适的改造甚至还能解决第一个挑战。纳米管能以一种独特的方式和方向与碱基结合， 而且每一个碱基的结合活化焓（binding activation enthalpie）为了便于控制DNA链通过纳米管的速度，也都处于可被温度、离子强度或偏置电压调控的范围之内。
要借助横向隧穿电流来分辨碱基还有一种方法，就是在化学修饰的金属电极和待测碱基之间形成碱基特异性的氢键。Ohshiro和Umezawa发现， 在STM中如果金属探针（电极）被A、G、C、U的硫氢基（thiol）修饰之后，电极和碱基之间的隧穿电流会被极大地放大。他们发现，使用经胞嘧啶修饰 过的探针（电极），可以区分出序列TTTTTTTTGTTTTTTTTT和序列TTTTTTTGGTTTTTTTTT。基于Ohshiro和 Umezawa的工作，Lindsay等人猜想，是否可以使用经两种不同化学修饰方法加工过的电极，令其中一组电极能结合核苷酸的磷酸基团，而另一对电极 能结合核苷酸的碱基基团（图11）。这样，在每一个核苷酸通过纳米孔中的“阅读器（电极）”时就会通过“电流距离”（current-distance） 而不是通过静态的“隧穿电流”而被检测出来。A、C、G、T四种“阅读器”中的每一种都会借助上面的功能基团与通过纳米孔的同一种碱基形成氢键。将这四种 阅读器链接在一起形成“DNA链”就可以对dsDNA链进行测序了。不过，要同时将四条dsDNA链穿过四个阅读器还是一大难题。
还有人提出可以将金属氧化硅电容和纳米孔技术结合在一起通过对DNA进行静电检测以达到测序的目的。透射电镜（transmission electron microscope, TEM）发射的电子束可以将纳米孔固定到两层掺杂硅构成的膜上（中间被厚约5nm的SiO2绝缘层隔开）。当有DNA链穿过纳米孔时，可以检测到两层硅膜 间电容的静电势和电压发生了改变。仿真结果表明，A、C、G、T都有其各自独特的电容信号，因此从理论上来说也可以通过这种方法进行测序。在早期的一次试 验中发现能够检测到DNA链通过纳米孔时引起的电压变化，但是由于时间太短，还无法区分出单个的碱基。目前，该方法面临的主要问题也是如何控制碱基通过纳 米孔时的速度和方向。
3. 获取较长的测序长度
纳米孔测序技术还有一个非常吸引人的优势，那就是测序距离长。因为纳米孔测序仪对通过的每个碱基进行测序，与前后的测序结果都无关。因此从原则上来 说，使用纳米孔测序技术，只要DNA链不发生断裂，并且能一直通过纳米孔，就可以一直检测下去。到目前为止，人们已经证明，长达25kb的ssDNA能够 一次性通过生物纳米孔，长达5.4kb的ssDNA能够一次性通过固态纳米孔。因此，如果检测技术能得到进一步的改善（能检测快速通过纳米孔的碱基），纳 米孔测序技术还是具有非常好的应用前景的。虽然现在还无法确切获悉纳米孔测序技术的准确度有多高，但可以确定插入、缺失等序列错误不会影响片段的读出长 度，因为相移在独立的单分子读序中并不是一个问题。只要所测序列是随机的，而不是系统的或具有位点依赖性的，那么足够高的序列覆盖率便可以保证任何水平的 准确度。
此外，虽然目前的第二代测序仪的测序长度较短，但它们具有高通量的优势，因此可以将纳米孔测序技术和这些第二代测序技术结合起来，以弥补第二代测序仪在测序长度方面的不足。
考虑到在未来的测序技术发展趋势中，测序长度是至关重要的一个指标，因此还需要进一步研究，以弄清纳米孔测序技术在检测ssDNA时测序的极限长度 是多少。纳米孔测序技术在检测单链寡聚物（不到50个碱基）时可以进行高通量检测，此时核酸链通过α溶血素纳米孔的速度大约是5.8个低聚物/sec μM。因为核酸链大分子穿过纳米孔的速度与其在溶液中的摩尔浓度有关，而摩尔浓度又不能太高以免溶液太粘稠，因此还需要进行试验验证50kb长的 ssDNA是否能以一个合适的速度通过纳米孔。已经有几篇论文报道指出，使用直径约3nm~6nm的纳米孔能够检测长约3kb~10kb的ssDNA及 dsDNA片段（核酸分子的浓度在10nM~20nM之间），不过文章中都没有提及核酸分子通过纳米孔的速度。此外，虽然Branton等人已经证实了 48kb的λ-DNA可以通过纳米孔，但是使用最新的纳米孔捕获及再捕获技术对长基因片段进行测序时的效率更高。纳米孔捕获及再捕获技术对于提高测序质量 非常重要，因为借助这种技术就可以对同一个碱基进行反复测序。当碱基初次通过纳米孔时，如果检测信号质量不高，实时监测软件就会“命令”该碱基再次通过纳 米孔并重新接受检测，直至获得满意的信号为止，而不需要重新准备样品，从头再测一次。
4. 控制DNA通过纳米孔
DNA高速通过纳米孔的特性使得高速测序成为可能，但同时这种高速度也正是很多纳米孔测序技术的“阿喀琉斯之踵（?Achilles? heel，意即弱点）”。因为速度太快，检测的信号质量就不高，甚至很多小的信号根本就检测不到。在120mV的条件下，DNA会以每个碱基 /1μs~20μs的速度通过α溶血素纳米孔。这就需要探测器的检测带宽达到MHz级，才能检测到皮安级的电流强度。
当DNA在电泳作用下通过纳米孔时，由于扩散作用的影响，降低了测序的质量。由于DNA分子的随机运动使得它通过纳米孔的时间，即通过时间 （transit time）的跨度非常大（这一点从理论上和试验上都已经证实了），因此，人们无法判断有多少碱基通过了纳米孔。而且，由于跨孔DNA分子与纳米孔表面间存 在的非特异性的相互作用还会受到非连续性的粘滑现象（discontinuous stick-slip phenomena）影响，所以相互作用会发生改变。这种相互作用改变的本质和频率会引起“逃避时间（escape time，解离时间）”发生非泊松分布（non-Poisson distribution），于是，同一种碱基分子通过纳米孔时的通过时间也会不同。而且，如果碱基分子通过纳米孔的时间小于平均通过时间，那么它极有可 能被漏检。
鉴于此，对于纳米孔测序技术来说，最为重要的一点就是如何控制并减慢DNA分子通过纳米孔的速度，同时尽量消除由于纳米孔表面相互作用给DNA分子 跨孔动力学上造成的波动现象。降温和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上减慢DNA分子通过纳米孔的速度，但这两种方法都不能消除因纳米孔表面相互作用造成 的跨孔动力学波动现象。真正能降低DNA跨孔速度的方法见表14。
上述这些限速步骤所达到的速度都在每个碱基/数毫秒级，同时还都会受到离子强度、温度以及跨孔偏置电压的影响。
最理想的状态是，如果能发现一种电信号来代表碱基间的“空隙”，那就能清楚地知道有多少个碱基通过了纳米孔了。这种信号对于分析跨孔动力学和碱基孔 内停留时间等都具有很高的使用价值，而且可以据此来决定测序仪的检测带宽和其它参数。但在该信号出现之前，人们还需弄清楚DNA的跨孔动力学，同时还要开 发出控制DNA跨孔速度的办法。纳米孔制造技术的发展使得我们能够制造出特殊的纳米孔，这些纳米孔的背景噪声很低，而且能够调控DNA与纳米孔表面的相互 作用。最终，将DNA跨孔速度控制技术、高带宽技术、低噪声检测技术结合在一起，就能制造出高速纳米孔测序仪了。
5. 生物纳米孔的稳定性问题和固态纳米孔的制造问题
溶血素七聚体（hemolysin heptamer）是最常用于在脂质双分子层中制造生物纳米孔的材料，它性质非常稳定。但脂质双分子层的性质却不那么稳定，尤其是液态脂质双分子层，制造起来极难且费时。
Bayley等人发现包裹在两层薄琼脂糖中的装载有α溶血素纳米孔的双分子层非常稳定，可以被装到特氟隆薄膜（Teflon film）中储存数周之久。同时他们还发现，α溶血素纳米孔可以被顶端是琼脂糖的塑料或玻璃探针装载到上述双分子层组成的芯片上。另一种稳定双分子层的方 法是使用纳米级的孔径而不是微米级的孔径。试验证明，在玻璃毛细管末端的直径为100nm~1,000nm的双分子层在包被有特殊硅烷化剂 （silanizing agent）的条件下能保持稳定达两周以上。
使用离子束雕刻（ion beam sculpting）、电子束钻孔（e-beam drilling）和原子层沉积（atomic layer deposition）等方法可以在氮化硅、氧化硅或其它金属氧化物等介质上“制作出”稳定的、有功能的固态纳米孔，不过要得到直径在 1.5nm~2.0nm的纳米孔芯片还是一件非常困难的工作。现在，人们已经可以制作出装载有用于检测隧穿电流探针的纳米孔，但是目前的纳米孔制作工艺非 常繁琐，速度慢又耗费人力，而且制作出的产品还常常无法达到应用的要求。毫无疑问，随着纳米电子学领域的不断发展，人们一定会制造出高质量的纳米孔芯片。 但是，直到纳米孔测序技术被证明是可行的那一天为止，纳米孔测序研究领域的科学家都会一直面临一个问题，那就是只能使用科研设备，而不可能使用大量生产的 商业化设备。
对于某些纳米孔测序技术来说，最稳定的纳米孔可能是固态纳米孔和α溶血素纳米孔的“杂交体”，即在氮化硅之类的人工膜上做出5nm左右的纳米孔，同时也装载上α溶血素纳米孔。如果这种方法可行，那么该杂交纳米孔就既有高度的重复性又有无限的稳定性。
6. 结论
如果纳米孔测序技术能够成功，那么它将是非常好的一种新的测序技术，因为它具有以下优点（表15）。