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分子生物学实验指导手册
目 录
实验一 培养基的配制及实验用品的灭菌 ........................................................................................................1 实验二 质粒DNA的分离提取 ..........................................................................................................................2 实验三 质粒DNA浓度和纯度的测定 ..............................................................................................................4 实验四 DNA的琼脂糖电泳鉴定 .......................................................................................................................4 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备 ................................................................................................................5 实验六 重组子的转化及阳性克隆的初步筛选.................................................................................................6 实验七 PCR .........................................................................................................................................................7 实验八 DNA的酶切及电泳鉴定 .......................................................................................................................8
实验一 培养基的配制及实验用品的灭菌
一、目的
1.1了解并掌握培养基的配制、分装方法 1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。 二、原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 三、材料 1、器皿及材料
天平、称量纸、药品匙、量筒、试管、三角瓶、培养皿、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、灭菌锅、干燥箱、1.5ml EP管、PCR管、枪头、枪头盒
2、药品试剂
胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂粉 四、步骤
1、LB液体培养基的配置及分装
配置：称取胰蛋白胨2.5g，酵母提取物 1.25 g，NaCl 2.5 g，溶于 200ml 蒸馏水中，彻底溶解后，加蒸馏水定容至总体积 250ml。
分装：量取100ml LB液体培养基分装到250ml 锥形瓶中，量取5ml LB液体培养基分装到玻璃试管中，共分装2个锥形瓶、5支试管。
2、LB固体培养基的配置
称取1.5g琼脂粉，加入至100ml LB液体培养基中。
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3、包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸或报纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
4、其他实验用品的包装标记
在铝饭盒中放入1.5ml EP管、PCR管及2个50ml离心管（旋松管盖），用棉绳系好，标记组别、姓名等；用防潮纸或报纸包好5个玻璃培养皿，标记组别和姓名等。
5、灭菌
把上述配好的各种培养基、实验用品放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20-30min，灭菌结束后放入干燥箱烘干备用。
6、含氨苄青霉素的LB固体平板制备
待LB固体培养基冷却到60℃时，在超净工作台中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100ug/ml，混匀后倒入灭菌的玻璃培养皿中，待培养基凝固后4℃保存备用。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
7、液体接菌培养
用微量移液枪吸取10ul菌液接种至灭菌的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，用于制备感受态实验。
在灭菌的5ml LB液体培养基中加入5ul 氨苄青霉素（100mg/ml），混匀后接入10ul TOP10大肠杆菌（含pLenti6-GFP质粒），37℃振荡培养过夜，用于质粒提取实验。
接菌的方法：按无菌操作法挑取少量菌种，先用微量移液枪吸取10ul菌液，左手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞，将枪头中的细菌接种到试管或三角瓶中，将试管塞或瓶塞盖好。
五、结果
准备好各种灭菌的培养基及实验用品用于后续实验 六、思考
1、制备培养基的一般程序是什么？
2、做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？ 3、灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？ 4、试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。 5、高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
实验二 质粒DNA的分离提取
一、目的
掌握质粒DNA分离纯化的原理与操作步骤； 二、原理
从大肠杆菌中提取质粒DNA常用碱性SDS法，该法提取质粒是基于质粒与染色体DNA的变性存在
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差异而予以分离的。在强碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性（双链解开）。由于质粒DNA分子小，而且是共价闭合环状超螺旋结构，变性后两条互补链不会完全分开。当溶液PH调节到中性时，质粒DNA容易复性并溶解在溶液中，而染色体DNA不容易复性，互相缠绕，在离心时极易和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。转移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的质粒DNA。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋 DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA) ；如果质粒 DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA) 。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
三、仪器与试剂 1、仪器
恒温摇床、小型高速离心机
2、试剂：快速质粒小提试剂盒（世纪康为 CW0511），组分包括
Buffer P1：50mmol/L葡萄糖 5mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） Buffer P2：0.2mol/L NaOH，1%（W/V）SDS（新鲜配置）。 Buffer N3：5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，双蒸水28.5mL。 Buffer PW：含有75%乙醇的缓冲液 Spin Column CM（吸附柱） 四、操作步骤
1、用微量移液器吸取10ul菌液，接种至5mL含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 220rpm摇床培养过夜（实验一中已完成）。
2、将1.5mL过夜培养的菌液转移至1.5ml EP管（Eppendorf离心管）内，10000rpm离心30秒，弃上清。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul预冷的Buffer P1，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀。
4、向离心管中加入250ul Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液应变得清亮粘稠。注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免造成基因组DAN污染，此步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。
5、向离心管中加入350ul Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀，13000rpm 离心10分钟。注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
6、将步骤5中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入750ul Buffer PW，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
8、将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
9、将吸附柱置于一个新的EP管中，向吸附膜的中间部位加入30ul 灭菌蒸馏水，室温放置5分钟，13000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。
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实验三 质粒DNA浓度和纯度的测定
一、目的
1、了解分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理 2、掌握分光光度法测定DNA浓度和纯度的方法 二、原理
质粒DNA样品的浓度和纯度是后续实验的关键，因此要对分离纯化的质粒进行浓度、纯度的测定。 核酸含量测定方法包括定磷法、紫外吸收法、地衣酚法和二苯胺法等，还可利用琼脂糖凝胶电泳判断核酸的浓度和纯度。其中紫外吸收法简单快捷、灵敏度高，是实验室中最常用的方法。
核酸分子结构中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在250-280nm紫外光区具有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右，因此可利用核酸的紫外吸收兴致进行定量测定。目前常利用分光光度计测定核酸溶液在260nm处的吸光值，通常1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；可以此来计算核酸样品的浓度（通常1ug/ml的DNA标准品溶液在260nm光吸收值为0.020；1ug/ml的RNA溶液为0.022，以此为标准，可测得溶液中的核酸含量）。
利用分光光度法通过测定核酸在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）可以判断核酸样品的纯度。纯DNA的A260/A280约为1.8；RNA的A260/A280约为2.0。DNA和RNA的比值分别低于1.8和2.0时，则表示此样品不纯，可能含有蛋白质等杂质。若DNA比值高于1.8，说明样品中有RNA污染。当然也会出现既含有RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以需要结合琼脂糖凝胶电泳等方法进一步进行测定。
【计算】 DNA浓度（ug/ml）=A260×1ug/ml×稀释倍数/0.020 DNA纯度=A260/A280（要求比值在1.8-2.0范围内） 三、仪器与试剂
紫外分光光度计、微量移液器、石英比色皿、质粒溶液、蒸馏水 四、步骤
1、样品准备：取实验二中提取得到的质粒溶液200ul，加入蒸馏水1800ul，混匀后待用。 2、以蒸馏水调零，用紫外分光光度计测定质粒溶液在260nm、280nm的吸光度值。 3、计算出DNA的浓度及纯度，分析是否有RNA或蛋白质污染。
实验四 DNA的琼脂糖电泳鉴定
一、目的
掌握琼脂糖凝胶制备与电泳的原理与方法。 二、原理
核酸带负电荷，在电场中向正极移动，移动快慢与分子大小成反比。电泳后，核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。染色剂溴化乙锭（EB），它能插入DNA积叠的碱基之间，导致和DNA 结合。在紫外光照射下，溴化乙锭-DNA复合物发射出橘红色荧光。
三、仪器与试剂 1、仪器
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