发布时间 : 星期五 文章分子生物学实验指导手册更新完毕开始阅读76f7fbbd05087632311212b6
电泳仪；电泳槽；紫外核酸检测仪 2、试剂
TAE电泳缓冲液（50×）：每升含Tris 242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）100mL DNA Marker：1kb ladder、DM2000 plus 6×DNA loading buffer （上样缓冲液） 四、操作步骤
1、将制胶板水平放置于模具内，插入合适的梳子；
2、称取1g琼脂糖于100 ml 1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50oC时倒入制胶板中；
3、凝胶凝固后，小心拔去梳子，将制胶板放入电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液；
4、吸取提取的质粒DNA 5ul，6×上样缓冲液1ul，混匀后点入加样孔中，另外吸取5ul DNA Marker依次点入加样孔中；
5、盖好盖子，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动，100V约30分钟；
6、电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入1ug/ml EB溶液中避光染色5分钟，染色结束后把凝胶置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。
实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备
一、目的
掌握感受态细胞的制备原理与操作步骤； 二、原理
在自然条件下, 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内, 但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ), 它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法( 如电击法，CaCl2等化学试剂法) 的处理后, 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移, 使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子( 即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求, 制备出的感受态细胞暂时不用时, 可加入占总体积15％的无菌甘油于-70 ℃保存(半年), 因此CaCl2 法使用更广泛。
三、仪器与试剂 1、仪器
恒温摇床；冷冻离心机；制冰机；分光光度计；超净工作台；灭菌的离心管（50ml和1.5ml）； 2、试剂
（1）0.1mol/L CaCl2溶液:称取1.11g CaCl2( 无水,分析纯), 溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。 （2）含15%甘油的0.1mol/L CaCl2: 称取1.11g CaCl2( 无水,分析纯), 溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
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四、操作步骤 （一）细菌的培养
吸取10ul TOP10大肠杆菌菌液，接种于5ml LB 液体培养基中,37 ℃下过夜振荡培养（实验一中已完成）。将该菌悬液以1:100-1:50 的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3 小时至OD600 ＝0.4-0.6 左右。
（二）感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入50ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000rpm 离心10分钟。
2、弃去上清，用预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30 分钟后,4℃下4000rpm离心10分钟。
3、弃去上清,加入2ml 预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl 的小份，可直接用于转化实验，也可贮存于4℃可保存一周。 五、注意事项
1、实验中所用的器皿均需要高压灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。
2、实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3、应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD600不应高于0.6 4、制备感受态细胞需要高纯度的CaCl2，并用超纯水配制。
5、整个实验一定要在冰浴条件下操作，温度时高时低会影响转化效率。
实验六 重组子的转化及阳性克隆的初步筛选
一、目的
学习将DNA分子转化进入受体菌的方法。 二、原理
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，体外连接的重组DNA分子必须经转化导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。常用的转化方法有热激法、电穿孔法，进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移, 使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant, 即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。
本实验用外源质粒pLenti6-GFP转化大肠杆菌TOO10感受态细胞进行复制扩增。用含氨苄青霉素的琼脂平板进行转化子的初步筛选，转化成功的受体菌具有氨苄的抗性，能够在含有抗生素的培养基上存活，而未受转化的受体细胞则因缺乏抵抗抗生素的能力而死亡。
三、步骤
1、新制备或4℃保存的感受态细胞悬液, 加入质粒DNA 溶液2-3ul(含量不超过50ng,体积不超过10μl), 轻轻摇匀,冰上放置30分钟。
2、42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。
3、 向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp), 混匀后37℃振荡培养 1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ) 。
4、将上述菌液摇匀后取 100 μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24 小时。
5、结果：培养皿中可见一个个菌落即为转化成功的阳性克隆。
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四、注意事项
1、转化效率与外源DNA的浓度成正比，如果加入外源DNA的量过多或体积过大，转化效率也都会下降，所以一般情况下DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10%。
2、42℃热处理很关键，温度要准确，转移速度要快。
实验七 PCR
一、目的
掌握PCR原理与操作步骤； 二、原理
PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 的方法.它包括三个基本步骤:
1、变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链;
2、退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50 ℃左右) 下与模板上的目的序列通过氢键配对; 3、延伸(Extension): 在Taq DNA 聚合酶合成 DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106倍。
本实验是从pLenti6-GFP质粒上扩增GFP（绿色荧光蛋白）基因。 三、仪器与试剂 1、仪器：PCR仪 2、试剂
2×Taq DNA 聚合酶预混液（含PCR buffer Mg2+、Taq酶、dNTP、染料）； 模板DNA（plenti6-GFP质粒）
引物（各10uM）：GFP-F: GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG GFP-R: CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG 四、操作步骤
1、PCR 反应体系（20ul）
2×PCR buffer（含Taq酶及染料） 10μl 模板 1μl GFP-F（10μM） 1μl GFP-R（10μM） 1μl 灭菌水 7μl 2、PCR反应程序
预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 30s
退火 55℃ 30s 30个循环 延伸 72℃ 1min 终延伸 72℃ 10min 3、产物分析
取10μl PCR产物加入琼脂糖凝胶孔中，100V电泳，至指示带电泳至2/3凝胶处时停止电泳，取出凝
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胶，凝胶成像仪中观察并拍照。
五、思考题
1、降低退火温度对反应有何影响？ 2、延长变性时间对反应有何影响？ 3、循环次数是否越多越好？为何？ 4、如果出现非特异性带,可能有哪些原因？
实验八 DNA的酶切及电泳鉴定
一、目的
掌握DNA酶切的原理与操作步骤； 二、原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA 。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA ，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G ↓AATTC-3'), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma Ⅰ:5'-CCC↓GGG-3'); 有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同, 各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度( 大多数为37℃)。对质粒 DNA 酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系 1 μg DNA 加1 单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
三、仪器与试剂
1、仪器：水浴锅、电泳仪 2、试剂：限制性内切酶及其缓冲液 四、操作步骤 1、酶切反应体系
反应体系 质粒DNA 10×酶反应缓冲液 BamH I EcoR I ddH2O 2、电泳
按前面所述,取10μl 扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
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20ul 10ul 2 ul 1 ul 1ul 6ul 混匀后瞬时离心，置于37度反应1小时。