发布时间 : 星期六 文章中图版高中生物考点加强课6限制酶的选择原则更新完毕开始阅读774c21e06337ee06eff9aef8941ea76e58fa4a38
1.限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不宜选择。
③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
(3)参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。(分析如下)
2.目的基因的检测与鉴定
(1)界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用： ①载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培
养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：
②“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？
经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。
(2)使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。
(3)采用“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 (4)采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。
【例证】 (2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是______________________________________________________ ____________________________________________________________________。 (2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图(c)所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有
，不能表达的原因是
_________________________________________________________________ _________________________________________________________________。
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________________________。 [慧眼识图 获取信息] (1)三种限制酶切割结果分析