发布时间 : 星期二 文章分子生物学实验课件更新完毕开始阅读77a4c01214791711cc7917bf
六、思考题
1、“E. coli DH5α菌株： Rˉ，Mˉ，Ampˉ”提供了哪些关于该菌株的信息？
2、步骤3中，为何在大肠杆菌转化完成后需要在不含Amp的LB培养基中缓慢振荡培养45 min后方能涂布于抗性筛选培养基上进行抗性筛选？
3、设对照1、2分别有什么目的？在上述实验中，我们实际做了哪个对照？
实验六 质粒DNA的限制性酶切、PCR扩增与检测
一、实验目的
掌握PCR、限制性内切酶酶切的技术原理和操作要点，增进对理论知识的理解。 二、实验原理
1、限制性内切酶酶切 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割产生平末端的DNA片段，有的切割位点在对称轴一侧产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。
2、PCR PCR即聚合链式反应，它是近年发展起来的一种体外扩增特异性DNA 的技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和４种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×10
3、琼脂糖凝胶电泳 参见实验三。
三、实验材料、设备及试剂
1. 上下游引物: 浓度为各10 pmol/μl。
6～7
2+
拷贝。
5' AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT 3',
5' AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGG 3'， 2．DNA模板：大豆基因组，浓度为100ng/μl。
4．10×buffer（购买Taq酶配套buffer）：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl，pH9.0，1% Triton-X 100 5．MgCl2：25mmol/L。
6．dNTP 2.5mmol/L：分别取等体积的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四种混合即成 7．Taq DNA聚合酶：浓度为2.5 U/μl。 8．灭菌双蒸水
9. 10X buffer（购买限制性内切酶配套buffer） 10. SalI限制性内切酶：10U/ul 11. 质粒DNA：200ng/5ul
12. 6×载样buffer：0.25% 二甲苯青FF，0.25% 溴酚蓝，30% 甘油
13．50×TAE 电泳Buffer： 12.2g Tris，2.85ml 冰醋酸，10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0)，加水至50ml。 14．溴化乙锭(EB)溶液：10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
15. DNA Marker
16．各种国产移液器(10，20，100μl)
17．消毒的0.2ml、１.５ml PCR管，10μl，100μl tips 18．恒温水浴锅 19．PCR仪
20．水平电泳槽和电泳仪 四、实验步骤
（一）PCR：
各种试剂置冰盒中，取已灭菌的0.2ml PCR管，于冰上按下表操作（注：根据质粒浓度来决定质粒模板的加入量）：反应体系配制（10μl体系） 试剂
DNA模板 10×buffer dNTP MgCl2
上下游引物
Taq DNA聚合酶 无菌ddH2O 总体积
加入量
1μl 2μl 1μl 0.5μl
1μl（各10 pmol/μl） 0.5μl (2.5 U/μl) 补足20μl 10μl
终浓度(或含量) 100ng 1×buffer 2.5mmol 约2.5mM/L 各10pmol 1.25U
用枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，编号。于PCR仪上进行PCR反应。 反应程序设置为：94℃ 预变性 5min
以下35次循环
94℃ 变性 55S 55℃ 退火 45s 72℃ 延伸 55s 最后 72℃ 7min
（二）限制性内切酶酶切： 试剂
加入量
终浓度(或含量)
质粒DNA 10×buffer Sal I 无菌ddH2O 总体积
xμl 1μl
0.1μl(10 U/μl) 补足10μl 10μl
500ng~1ug 1×buffer 1U
注：加入质粒DNA溶液的体积根据实验五电泳结果决定，取的体积保证加入的质粒为500 ng~1ug即可。 加盖，混匀后稍离心，37℃水浴反应3h。反应完毕，于80℃水浴20min使酶失活。
（三）琼脂糖凝胶电泳 步骤略，请自行设计实验步骤。
五.实验结果分析
由琼脂糖凝胶电泳结果分析PCR结果如何？限制性内切酶酶切结果如何？预期应是怎样的电泳结果？如果电泳结果与预期不符，请分析原因。
实验七 细菌染色体DNA的提取
一、实验目的
了解细菌染色体DNA的制备方法与原理，掌握其操作步骤。 二、实验原理
从细菌中分离染色体DNA包括几个基本步骤：收集细胞；由溶菌酶水解肽聚糖的糖苷键从而破坏细菌细胞壁；蛋白酶K降解蛋白质成为小分子肽段；酚、氯仿变性、抽提溶液中的蛋白质；无水乙醇或异丙醇沉淀DNA就能得到质量稳定的染色体DNA。 三、实验材料
普通细菌 四、实验设备
微量取液器(100μl,1000μl)， 台式高速离心机，制冰机 五、试剂
溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。
3 mol/L NaAc（pH5.2）、 Tris饱和酚/氯仿（1?1）、TE缓冲液、RNase 六、实验步骤
1. 取菌液1mL，12000rpm离心1min，弃上清。
2. 加入100 μL溶液I，在漩涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散。 3. 再加入650 μL 溶液I，振荡混匀。
4. 向悬液中加入7.5 μL的100mg/mL溶菌酶至终浓度为1mg/mL，混匀，37℃温浴30分钟。 5. 向悬液中加入7.5 μL蛋白酶K（10mg/mL），混匀，55℃继续温浴1-1.5 h，中间轻缓颠倒离心管数
次。
6. 温浴结束后向溶液中加入用等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液(750 μL)抽提，12000rpm离心5min；取上
清再用等体积的氯仿/异戊醇溶液抽提一次，12000rpm离心5min。
7. 取上清（约500 μL ）至新的离心管中，向上清中加入1/10体积（约50 μL ）的3 mol/L醋酸钠（pH5.2）
混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃静止30分钟沉淀DNA，取出， 4℃ 12000rpm离心10min，弃上清（注意别将沉淀倒掉）。
8. 用1mL 70%酒精洗涤，弃上清，沉淀放入37℃烘箱中数分钟除去酒精。 9. 用40 μL TE溶解，加入2uL RNaseA，37℃温浴20min，-20 ℃保存。
实验八 植物基因组DNA的提取
一、实验目的：
学习植物DNA分离的原理，掌握植物基因组DNA提取的方法。 二、实验原理
由于植物细胞有细胞壁及其细胞内高含量的多糖类物质，因此用于真核细胞基因组DNA提取的一般方法用在植物细胞上并不十分有效。常用的方法有CTAB法和SDS法。这里我们采用CTAB法进行植物基因组DNA的提取。
CTAB法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。本方法通过液氮研磨粉碎植物组织、裂解液（CTAB溶液）裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 三、试剂与仪器设备：
1、CTAB Buffer (裂解Buffer)
CTAB 2％（w/v） Tris-HCl（pH 8.0） 100 mM EDTA（pH 8.0） 20 mM NaCl 1.4 M 2、氯仿/异戊醇（24:1） 3、3M NaAc 4、RNaseA 10mg/ml 5、异丙醇 6、β-巯基乙醇
7、氯仿/异戊醇（25/24/1） 8、70%乙醇
9、恒温水浴锅 ，台式高速离心机 10、液氮，液氮罐